2019年2月新文 10X單細胞轉錄組 僅需4個樣本?。。?/h1>

發(fā)稿時間：2019-02-20來源：天昊生物

Cell Reports: The Neonatal and Adult Human Testis Defined at the Single-Cell Level

研究背景

精子形成過程更多地在嚙齒類動物中被研究，而對人類精子形成的過程知之甚少，并且兩者之間存在顯著不同。在人類的相關研究中，精原干細胞（SSCs）是一個焦點，因為其在臨床上可能被用于治療不育；另外一個較活躍的領域則是鑒別標記SSCs的蛋白marker和形態(tài)學研究。然而很多這些marker并不能鑒別未分化的精原細胞（SPG），也不能區(qū)分分化中的SPG。當前的SPG單細胞RNA測序（scRNA-Seq）文章主要排除了其它睪丸細胞進行的分析，或多或少存在著一定的局限性¹，而這篇文章理論上分析了人類睪丸樣本中所有的細胞類型²。

主要內容

1. scRNA-Seq揭示成人睪丸樣本中SPG細胞亞群

利用10X Genomics Chromium Single Cell Kit [v2 chemistry]進行文庫制備，scRNA-Seq分析了兩個能生育個體的睪丸細胞樣本（37y和42y），質控后共18723個細胞用于后續(xù)分析。其中多種已知的睪丸細胞類型被發(fā)現，包括SPG和SPC（精母細胞）等（圖1A），而進一步對SPG細胞亞群進行分析發(fā)現其由4種不同的細胞群體組成，包括SSC-1, SSC-2,早期分化的SPG及分化的SPG（圖1B）。SSC-1和SSC-2中多數細胞有明顯的細胞周期基因表達特征，表明它們處于G0或G1期，而較少的細胞處于S期或G2/M期，這也說明多數SSC-1和SSC-2細胞并未增殖或經歷緩慢增殖（圖1C-D）。為了探索這四種SPG亞群之間發(fā)育關系，基于差異表達的基因進行了Monocle擬時軌跡分析，將單個細胞沿發(fā)育軌跡進行排列，結果表明這些細胞亞群按如下發(fā)育順序：SSC-1→SSC-2→Early diff-SPG→Diff-SPG（圖1E）。

圖1成人睪丸樣本中SPG細胞亞群

2. 過渡細胞及3種未分化SPG狀態(tài)的發(fā)現

Monocle分析發(fā)現在擬時軌跡線性路徑中存在一類分支細胞（圖1E頂部），這類Monocle定義的細胞又具有三類不同的細胞亞群的特征—SSC-1, SSC-2和早期分化的SPG，聚類分析也能將這些細胞聚在一起，繼而推測這些細胞可能是由一類過渡細胞（Transition Cells, TCs）組成，將SSC和分化的SPG階段連接起來（圖2A）。而支持這一假設的依據則為marker基因的表達在早期和晚期細胞中均有出現，而TCs中也共表達了SSC-1和SSC-2中的marker基因（圖2A下，2B），在分析過程中也排除了可能由cell doublets帶來的影響。

在SSC-1中發(fā)現一些基因表達在明顯不同的區(qū)域（zones），可能是在SSC-1亞群中存在不同的細胞狀態(tài)（圖1B底部），因此僅對SSC-1細胞進行聚類分析。結果顯示了三類亞群的存在—SSC-1A, SSC-1B和SSC-1C（圖2C-D），三類細胞亞群選擇性表達特定的marker基因（圖2E）。擬時軌跡分析也發(fā)現這三類細胞或單獨，或與其它細胞聯合，其中SSC-1B細胞富集了最多的SSC（圖2F）。

圖2 未分化SPG亞群

3. 候選的SSC蛋白marker的鑒別

鑒別人的SSC蛋白marker對于人的SSC研究至關重要，因此利用IHC和IF的方法分別鑒定未分化SPG的marker（圖3A-C），結合單細胞測序分析發(fā)現PIWIL4和LPPR3能夠標記一類高度特異性的未分化SPG亞群，具有SSC的特征。

圖3 未分化SPG marker鑒定

4. 新生兒睪丸樣本中的細胞亞群

為了評估成人睪丸原始未分化SPG細胞的發(fā)育起源，研究人員又利用scRNA-Seq分析了新生兒睪丸樣本，質控后來源于兩位新生兒（2d和7d）睪丸的14862個細胞被分析。基于已知的marker基因通過聚類分析發(fā)現了5種細胞亞群（圖4A）。為了進一步闡明新生兒睪丸中生殖細胞（germ cells）的本質，僅對germ cells進行聚類分析，基于一些marker基因又發(fā)現了2種新生兒germ cells亞群（圖4B），即PGCL和PreSPG（PreSPG-1和PreSPG-2）。

為了進一步揭示這三類新生兒germ cell亞群，將已發(fā)表的單細胞轉錄組數據納入分析，數據來源于4w-19w胎兒的PGCs ADDIN EN.CITE  ADDIN EN.CITE.DATA ³。Pearson相關性分析發(fā)現所有5個妊娠期的PGCs基因的平均表達水平與PGCL亞群相近（圖4C）。進一步探尋PGCs和germ cell數據間的發(fā)育關系，再進行Monocle軌跡分析，基于marker基因發(fā)現這些細胞亞群按如下發(fā)育順序：PGC→PGCL→PreSPGs（圖4D）。

5. PGCL蛋白marker的鑒別

數據表明PGCL亞群在胚胎PGCs和成人SPG間是一個重要的過渡階段，利用IHC方法對PGCLs中差異表達基因進行鑒定以尋找特定的蛋白marker，發(fā)現3種蛋白，ETV4, PIM2和POU5F1選擇性標記這些細胞（圖4E）。

6. 新生兒germ cell發(fā)展到近成人SSC的狀態(tài)

為了確定新生兒germ cell和成人SSC之間的關系，對兩者進行合并聚類分析，其中SSC-1細胞形成了大的細胞群，囊括了PreSPG-1和PreSPG-2（圖4F）。擬時軌跡較好地驗證了PGCL細胞是最未分化的新生兒細胞亞群，其它依次為PreSPG-2, PreSPG-1和SSC-1（圖4G）。

圖4新生兒睪丸樣本中的細胞亞群

7. 體細胞出現在發(fā)育的和成人的睪丸中

為了更精確的確定新生兒和成人睪丸中的體細胞，需要僅對新生兒和成人睪丸中的體細胞進行聚類分析（圖5A-B），細胞周期基因表達分析發(fā)現體細胞幾乎沒有處于細胞周期的更新中（圖5C）。類似于以上分析步驟，對這些體細胞群也進行了marker基因分析和擬時軌跡分析（圖5D-F）。

圖5 睪丸樣本中體細胞亞群分析

結論

男性生殖細胞發(fā)育是個復雜的過程，從胚胎生殖細胞到PGCs，再通過一系列狀態(tài)的改變，包括增殖、凋亡和分化形成SSCs，SSCs通過自我更新和分化，繼而生成精子。生殖細胞發(fā)育過程模型如圖6所示。

圖6 男性配子發(fā)育過程模型圖

參考文獻：

1.  Guo, J. et al. Chromatin and Single-Cell RNA-Seq Profiling Reveal Dynamic Signaling and Metabolic Transitions during Human Spermatogonial Stem Cell Development. Cell Stem Cell 21, 533-546 e6 (2017).

2.  Sohni, A. et al. The Neonatal and Adult Human Testis Defined at the Single-Cell Level. Cell Rep 26, 1501-1517 e4 (2019).

3.  Guo, F. et al. The Transcriptome and DNA Methylome Landscapes of Human Primordial Germ Cells. Cell 161, 1437-52 (2015).