Gut：腸道微生物可作為早期肝癌靶向非侵入性診斷標志物

發(fā)稿時間：2018-09-10來源：天昊生物

     

英文題目: Gut microbiome analysis as a tool towards targeted non-invasive biomarkers for early hepatocellular carcinoma

中文題目：腸道微生物可作為早期肝癌靶向非侵入性診斷生物標志物

期刊名：Gut

影響因子： 17.016

發(fā)表時間：2018年7月

研究背景:

肝癌已經(jīng)成為了所有癌癥中排名第三的“殺手”，根據(jù)2015年的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，中國新發(fā)肝癌病例達到46.6萬，其中男性的數(shù)量約為女性的3倍。發(fā)病率高的同時，預后也讓人感到擔憂，原因之一就在于早期診斷很困難。肝癌因為缺少特異性的標志物，很多患者確診時就已經(jīng)是晚期了，死亡率與發(fā)病率的比值能夠達到0.95。因此，迫切需要新的早期肝癌診斷標志物。

研究目的:

• 研究肝癌（HCC）患者腸道菌群特征；
• 尋找肝癌（HCC）非侵襲性微生物診斷標志物。

研究對象：

本研究共收集了來自華東，華中和西北地區(qū)的486份糞便樣本， 經(jīng)過嚴格的病理診斷和排除過程，完成了419個樣本16S Miseq測序，隨機將其中321個樣本分為發(fā)現(xiàn)組和驗證組：在發(fā)現(xiàn)階段，通過75例早期肝癌患者、40例肝硬化患者和75例健康對照進行了腸道微生物特征解析；利用早期肝癌患者隊列與非肝癌患者隊列（肝硬化患者和健康對照）進行了微生物標志物鑒定和肝癌診斷分類器構建；在驗證階段，接著對56例健康對照、30例早期肝癌患者和45例晚期肝癌患者對肝癌診斷分類器進行了驗證。進一步通過對新疆的18個肝癌患者和鄭州的80個肝癌患者對肝癌診斷分類器進行了獨立診斷驗證。

圖1研究設計流程圖。

研究結果：

參與者特點

• 在發(fā)現(xiàn)隊列中（75例早期肝癌患者、40例肝硬化患者和75例健康對照）這3組參與者的臨床特征包括年齡、性別和體重指數(shù)是匹配的。相對于對照組和肝硬化患者，血清甲胎蛋白水平在早期肝癌患者顯著升高（表1）。血清丙氨酸氨基轉移酶，天冬氨酸轉氨酶、谷氨酰轉肽酶、總膽紅素、直接膽紅素在早期肝癌患者明顯升高，而總蛋白、白蛋白和血小板濃度則顯著降低。

表1發(fā)現(xiàn)階段受試者的臨床特征

糞便形狀和濕度

• 首先基于糞便常規(guī)測試評估糞便形態(tài)，并通過冷凍凍干試驗測量糞便濕度。發(fā)現(xiàn)隊列和驗證隊列所有樣本的糞便特征是軟的。發(fā)現(xiàn)階段早期肝癌、肝硬化和健康對照組之間以及驗證階段對照、早期肝癌、晚期肝癌、新疆和鄭州樣本之間的糞便顏色均無顯著差異。
• 在糞便水分方面，發(fā)現(xiàn)階段早期肝癌、肝硬化和健康對照組以及驗證階段對照組、早期肝癌、晚期肝癌、新疆樣本和鄭州樣本之間沒有顯著差異。

早期肝癌患者腸道微生物多樣性降低

• 相對于健康對照組，肝硬化患者腸道微生物多樣性顯著降低；相對于肝硬化，早期肝癌患者腸道微生物多樣性增加（圖2A）。
• 相對于健康對照組，肝硬化患者糞便微生物多樣性指數(shù)（Shannon index, Simpson index and Invsimpson index）顯著降低, 相對于肝硬化，早期肝癌患者腸道微生物多樣性增加（圖2B-D），
• Venn圖顯示三組共932個OTU中有524個共享。值得注意的是，932個OTU中的90個對于早期肝癌患者是特異的（圖2E）。

圖2早期肝癌患者、肝硬化患者和健康對照的腸道微生物多樣性

糞便微生物群落組成

• 擬桿菌屬、厚壁菌屬和變形桿菌屬占總序列90%以上，為三個群體中的優(yōu)勢種群（圖3A）。與肝硬化患者相比，早期肝癌患者的放線菌門明顯增加（圖3C）。而且包括Gemmiger、Parabacteroides和Paraprevotella在內(nèi)的13個菌屬在早期肝癌患者明顯增加（圖3D）。
• 與健康人相比，早期肝癌患者疣微菌門（Verrucomicrobia）細菌明顯減少（圖3E），從屬的水平上來看，包括Alistipes、考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）和瘤胃球菌屬（Ruminococcus）在內(nèi)的12個屬的細菌也明顯減少了，與此同時，包括克雷伯氏菌屬（Klebsiella）和嗜血菌屬（Haemophilus）在內(nèi)的6個屬的細菌則增加了（圖3F-G）。
• 通過LEfSe分析，肝硬化患者與早期肝癌患者，還有健康人與早期肝癌患者之間的腸道微生物組成有顯著差異，這為建立腸道微生物標志物的早期肝癌患斷模型提供了可能。

圖3早期肝癌患者、肝硬化患者和健康對照腸道微生物組成。

早期肝癌微生物標志物的鑒定

• 我們構建了一個隨機森林分類模型，可以特異性地將非肝癌患者和早期肝癌患者樣本區(qū)分。為了檢測早期肝癌的特異OTU標記，我們通過發(fā)現(xiàn)階段的75個早期肝癌和115個非肝癌樣本（40個肝硬化和75個對照）對隨機森林模型進行了五重交叉驗證。結果發(fā)現(xiàn)，30個OTU標記被選為最佳標記集（圖4A）。
• 使用發(fā)現(xiàn)的30個OTU最佳標記集對發(fā)現(xiàn)隊列和驗證隊列的POD指數(shù)進行計算。在發(fā)現(xiàn)階段,非肝癌患者和早期肝癌患者的AUC值為80.64%，95% CI為74.47%～86.8%（圖4B）。早期肝癌樣本與非肝癌樣本相比，POD值顯著增加（圖4C）。這些數(shù)據(jù)表明，基于微生物OTU標記的POD對區(qū)分非肝癌患者和早期肝癌患者樣本具有強大的診斷潛力。

圖4通過隨機森林模型鑒定早期肝癌微生物標志物

肝癌微生物標志物驗證與獨立診斷

• 在驗證階段，56個對照，30個早期肝癌和45個晚期肝癌用于驗證POD對肝癌的診斷功效，計算每個患者的每個POD。
• 30例早期肝癌患者的平均POD值顯著高于56例對照組，POD的AUC值為76.80％，其驗證了對早期肝癌的診斷潛力（圖5A）。
• 為了說明POD對肝癌的特異性，我們進一步招募晚期肝癌患者以驗證其診斷潛力。結果表明，45例晚期肝癌患者的POD值顯著高于56例對照組（圖5A），晚期肝癌患者（圖5C）AUC值達到80.40％,這表明對晚期肝癌具有明顯的診斷功效。
• 為了進一步確定POD的診斷潛力和診斷范圍，來自新疆（中國西北）的18例肝癌患者和來自鄭州（中國中部）的80例肝癌患者作為獨立診斷來驗證POD可靠性。新疆18例肝癌和鄭州80例肝癌與56例對照的平均POD值比較具有顯著增加(圖5A)。其中來自新疆的18例肝癌AUC值達到79.20%(圖5D)。鄭州80例肝癌的AUC值為81.70%（圖5E）,這些結果表明基于微生物標志物的POD對中國西北部和中部地區(qū)肝癌患者有很強的診斷作用。

圖5肝癌微生物標志物的驗證和獨立診斷。

研究結論：

1.  從肝硬化到早期肝癌糞便微生物多樣性增加。

2.  相對于肝硬化，放線菌門在早期肝癌患者增加，包括Gemmiger、Parabacteroides和Paraprevotella在內(nèi)的13個菌屬在早期肝癌患者明顯增加。

3.  相對于對照，產(chǎn)丁酸屬減少，而產(chǎn)生脂多糖（LPS）的屬在在早期肝癌患者增加。丁酸鹽作為腸粘膜的主要能量來源，被認為是宿主細胞中基因表達，炎癥，分化和凋亡的重要調節(jié)因子，在細菌能量代謝和腸道健康中起著關鍵作用。因此，產(chǎn)生丁酸鹽的細菌的減少可促進腸粘膜破壞，從而有可能促使了肝癌的發(fā)生。LPS的增加引發(fā)各種病理生理級聯(lián)反應，高水平的LPS激活NF-κB通路，產(chǎn)生促炎細胞因子（TNF-α，IL-6和IL-1）并導致肝臟炎癥和氧化損傷，從而促使肝癌的發(fā)生。

4.  通過5次隨機森林模型的交叉驗證，確定了30個最合適微生物標記，在75個早期肝癌患者和105個非肝癌患者樣本之間獲得了80.64%的AUC值。

5.  值得注意的是，腸道微生物標志物對早期肝癌患者甚至晚期肝癌患者具有很強的診斷潛力。重要的是，這些微生物標記物成功地實現(xiàn)了在西北和華中地區(qū)肝癌的跨區(qū)域驗證。