喜訊！天昊生物微生物項目文章登陸《Environmental Pollution》

發(fā)稿時間：2020-09-22來源：天昊生物

水生環(huán)境中的重金屬（HMs）主要影響魚類，因此魚類是便捷的污染生物指示劑。此研究調(diào)查了重金屬（HMs）28天內(nèi)混合物（鉻（Cr）、鎘（Cd）、銅（Cu））在0-3.2mg/L濃度范圍內(nèi)對鯉魚的毒性作用。對重金屬積累，組織病理學，氧化應激和腸道微生物變化進行了評估。 HMs的積累順序為Cr>Cu>Cd，主要在腎臟，最后是鱗片。直到第14天，所有暴露組中活性氧的產(chǎn)生均增加，最大產(chǎn)生量為3.2 mg / L混合物，后來在第28天下降。丙二醛和超氧化物歧化酶水平從第7天到第28天隨著重金屬（HMs）濃度的增加而增加，而總蛋白則呈相反的趨勢。鰓組織病理學改變主要表現(xiàn)為初級板層隆起、解體、次級板層縮短。腎臟表現(xiàn)為腎小球壞死、鮑曼囊擴張和腎小管間隙擴張。在0.8mg/L和3.2mg/L處理組中，Proteobacteria和 Firmicutes的豐度分別增加了59.4%和99.16%。本研究對多重重金屬（HMs）脅迫下鯉魚的生理和腸道菌群的變化有了更深入的了解。

魚類養(yǎng)護與實驗魚的選擇：

從甘肅省蘭州市當?shù)佤~市場購買了150多個鯉魚標本，這些標本是從黃河（YR）的不同位置采集的。使魚在自然光周期（光照14小時/ 10小時黑暗周期）和環(huán)境溫度（20-25°C）下在玻璃水族箱中適應至少兩周。魚的重量和長度分別在25-40g和12-15cm之間。在整個適應過程中，每天用自來水更新水箱中50％的水，并連續(xù)通氣（pH = 8.12，溶解氧（DO）= 5.7 mg / L，總?cè)芙夤腆w= 346.4 mg / L，鹽度= 236 mg / L，電導率= 481.4 μS / cm）。用商業(yè)食品飼料（含有海藻粉、新鮮魚粉、蝦粉、小麥面筋和大豆圓酵母；粗蛋白：26%；粗纖維：8%；水分：10%；維生素：450毫克/千克），每天兩次（12:00和6:30）。喂食前使用ICP-OES確認沒有重金屬（HMs）。每天監(jiān)測水質(zhì)pH值、溶解氧和溫度。選擇健康魚（未患?。┻M行下游實驗，通過一般外觀（如顏色、皮膚光澤、眼睛和行為）確認。

重金屬暴露實驗裝置：

適應兩周后，魚被分為5組（n=10）在5個不同的50L水箱中。4組添加了重金屬（HMs）混合物，剩余一組作為對照（不加HMs）。分析了從5個不同位置收集的黃河水樣品，以選擇本研究的HMs類型和濃度范圍。使用以下HMs和濃度：0 mg / L（對照），0.05 mg / L，0.2 mg / L，0.8 mg / L和3.2 mg / L K₂Cr₂O₇，CdCl ₂和CuSO₄ . 5H₂O。三種HMs中Cu的濃度最低（0.049mg/L），最高的是Cr（2.86mg/L）。每天，用含有相應HMs濃度的自來水替換水箱中50%的水，以保持重金屬（HMs）水平并確保適當?shù)乃|(zhì)。在整個實驗過程中，每天監(jiān)測pH值、溶解氧和溫度。

檢測組織中的重金屬：

將魚饑餓至少24 h，然后在冰上麻醉，解剖前記錄其長度和重量。每組中的三條魚在每個時間點被處死。在進一步分析之前，所有被解剖的魚組織都儲存在?20°C的溫度下，然后將組織首先凍干，在80°C下干燥過夜，隨后稱重肌肉、皮膚、鱗片、腸、鰓和腎臟樣本，并用4.5 mL濃硝酸和0.5 mL過氧化氫溶液（30%）預消化過夜，然后將樣品在蒸煮器中于175°C進一步消化2小時，隨后冷卻，過濾提取物，并使用Milli-Q純水將體積提高至25 mL，采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜法檢查制備樣品中的HMs（Cr、Cd和Cu）。

組織病理學變化和氧化應激檢測：

察鰓和腎組織的組織病理學變化和氧化應激。解剖組織用4%中性緩沖甲醛溶液固定，光鏡觀察。固定后（至少18-24小時），將組織在梯度乙醇溶液中脫水并植入石蠟中，用旋轉(zhuǎn)切片機切割6μm厚的細切片，放置在玻片上，用蘇木精和伊紅（HE）染色，用DPX固定。為了測定氧化應激，測定活性氧（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和總蛋白（TP）活性，收集組織并在?80°C下立即保存在2?mL離心管中，直到進一步分析，樣品在0.89%冰鹽水中均質(zhì)，然后在12000×g下離心20min，樣品上清液用于ROS、SOD、MDA和TP生化分析：簡而言之，使用2?，7?-二氯熒光素二乙酸酯（DCF-DA）熒光探針在發(fā)射波長530?nm和激發(fā)波長485?nm處監(jiān)測ROS的產(chǎn)生；用羥胺法測定超氧化物歧化酶（U蛋白/mg）活性；采用2-硫代巴比妥酸（TBA）法測定MDA（nmol-protein/mg）；以牛血清白蛋白為參考標準，考馬斯亮藍G-250測定TP（g蛋白/L）。

高通量測序：

從每個水箱收集腸，并混合成一個樣本，分別在第7、14和28天收樣。從對照組、0.8 mg/L和3.2 mg/L水箱中收集樣品，將樣品轉(zhuǎn)移到含有磷酸鹽緩沖鹽水（PBS；pH=7.4）的2mL高壓滅菌管中，在?80°C下儲存，使用DNeasy Blood & Tissue kit（Illumina，USA）提取DNA，然后進行16S擴增子測序（V3-V4）。

鯉魚對重金屬（HMs）的吸收及由此引起的危害極為敏感，因此可以作為一個合適的污染指標。高濃度下的HMs吸收（0.8 mg/L和3.2mg/L）引起嚴重的組織損傷、活性氧生成和腸道微生物群失調(diào)，影響其健康和生存。HMs暴露引起的腸道微生物群失衡可能是導致觀察到致死性的主要原因之一。Cr是最大吸收的重金屬（HMs），因此可能是中毒和腸道菌群變化的主要因素。本研究將進一步提供一個深入的研究范圍，以了解腸道微生物群與應激源競爭的機制，以維持腸道功能和魚類健康。人類食用受重金屬污染的魚類會導致重金屬在人體內(nèi)的累積，導致類似的負面生理效應，并可能導致死亡。因此，重金屬污染的魚類需要在人類食用前進行處理。

魚類組織對重金屬的吸收

暴露于Cr、Cd、Cu的混合物會導致魚類的異常行為，如食物排斥、糞便排泄減少、缺乏游泳協(xié)調(diào)性、向水面移動、鰓蓋快速但不規(guī)則的移動、以及一側(cè)持續(xù)靜止不動。這些行為在3.2mg/L組是極端明顯的，實驗18天后，該組的死亡率為100%，這種行為可能是神經(jīng)元活動受到抑制的結(jié)果。腸道微生物群的變化可能會改變魚類的生長、健康、性能、飼料效率和飼料轉(zhuǎn)化率。與對照組相比，各暴露組的重金屬（HMs）累積量有顯著差異。魚的HMs在第28天的累積順序為Cr>Cu>Cd，并經(jīng)常以魚中的腎臟>腮>腸>皮膚>肌肉>魚鱗的形式積累（圖1）。據(jù)報道，食用魚類中HMs的允許限量為：1 μg / g Cr，30 μg / g Cu和0.5 μg / g Cd。在第28天，暴露組的三個HMs都大大超過了允許的限值（圖1C、F、I、L、O和R）。HMs在魚類組織中的積累程度受魚類類型（年齡、屬和體重）和棲息地、水中金屬類別、水狀況（溫度、透明度和pH值）、溶解氧豐度和生理條件的調(diào)節(jié)。雖然不同器官/組織的吸收不同，但魚體內(nèi)金屬的主要進入途徑是鰓，魚類可以通過攝入的飼料和懸浮在水中的顆粒固體、通過親油性組織進行離子交換和皮膚吸附來吸收HMs。Cr在所有組織中的吸收量最大，其次是Cu 和Cd（圖1）。因此，Cr的過度沉積對人類食用此類魚類造成了非常高的風險。與Cu 和Cd相比，高濃度Cr吸收主要有兩個原因：1）Cr更容易被吸收，因為它是一種強氧化劑，有更強的穿過細胞膜的傾向；2）pH值在6到8之間強烈影響生物利用度、敏感性和魚類對Cr（VI）的吸收。pH值7.8和6.5分別更適合Cr在內(nèi)臟和鰓中的積累，在這項研究中，水的pH值保持在7到8之間（圖S1）。Cu是哺乳動物和魚類必需的微量營養(yǎng)素（5-20 μg / g），但濃度過高會導致毒性，腸道中的Cu濃度在第14天和第28天達到0.02 mg / L的峰值（圖1K和L），因此可能沒有表現(xiàn)出顯著的毒性作用。除鰓在高濃度下（圖1 M、N和O），Cd在所有部位的吸收最少，這與別人觀察到斑馬魚鰓中Cd積累較多的研究相似。

腎臟樣品中的HMs積累經(jīng)常是最高的（圖1P和Q），因為它是使污染物排毒以減輕有害影響的器官。腎臟在第28天的累積水平略有下降，這可能是由于HMs引起的腎臟損傷。因此，與Cu和Cd相比，Cr是吸收最活躍的HMs。

圖1 暴露7、14和28天時，肌肉、皮膚、鱗片、腸道、鰓和腎臟對重金屬的吸收。

鰓和腎臟的組織病理學變化

與對照組相比，HMs混合物對鰓和腎臟的損害作用顯著，基本上是在暴露14天和28天后（圖2）。對照組鰓的組織病理學分析顯示正常，其特征是存在初級板層（PL）、次級板層（SL）和層間層（IL）。與此相反，暴露組的鰓有組織異常，包括初級板層融合、初級板層剝離和隆起、血管損傷、層間層變薄、充血、次級板層縮短和組織破裂，這表明廣泛的組織損傷（圖2）。在0.05 mg / L組中，直到第14天變化并不十分明顯，但在第28天損害明顯（圖2B）。在0.2 mg / L組中（圖2C），與0.05 mg / L組相比，變化更為明顯，并且在第28天更為離散；在高濃度下，變化更為明顯，在第28天，這種損害在0.8 mg / L組中普遍存在（圖2D）；而在3.2 mg / L組中，從第7天起就非常明確（圖2E）。銅的主要積累器官是肝臟，因此在本研究中，銅對鰓和腎組織沒有明顯的影響。

圖2 暴露7、14和28天鰓的組織病理學變化：A）對照組：正常組織外觀，顯示清晰的初級板層（PL）、次級板層（SL）和層間層（IL）；B）0.05 mg/L：血管受損（DBV）、板層融合（LF）和初級板層隆起（UPL）；C）0.2 mg/L：充血（CN），隆起原發(fā)性板層（UPL）、原發(fā)性板層崩解（DPL）、層間層（IL）變?。^）；D）0.8 mg/L：次級板層縮短（SSL）、板層崩解（LD）、廣泛組織損傷，表現(xiàn)為板層變薄、完全板層破裂（LR）和IL（箭頭）變?。?/span>E） 3.2mg/L：次級板層縮短（SSL）、層間層（IL）變薄（箭頭）、初級板層隆起（UPL）、IL破裂（ILR）。

腎臟是最早受到污染物影響的器官之一，在消除有害物質(zhì)方面非常重要。HMs暴露后，腎臟結(jié)構被破壞，表現(xiàn)為腎小球壞死（GN）、腎小管間隙擴張、腎小管充血、腎小管變性和鮑曼囊擴張。盡管0.05 mg/L和0.2 mg/L組的腎小球壞死（GN）并不明顯，但0.8 mg/L和3.2 mg/L組顯示出顯著變化（圖3），這些變化，包括鮑曼氏囊變性，腎小球腎炎，腎小管管腔減少。0.05 mg/L組在第28天的損傷更為突出（圖3B）；0.2 mg/L組在暴露14天時損傷更為明顯（圖3C）；0.8mg/L組損傷強度在第28天最高，在第7天和第14天稍低（圖3D）；在3.2 mg / L組中，從第7天起破壞就很強烈（圖3E）。這表明HMs可以破壞組織結(jié)構，并且隨著HMs濃度的增加，破壞作用增加，因此，組織病理學變化可以指示環(huán)境污染。

圖3 暴露第7、14和28天腎臟的組織病理學變化：A）對照組：正常組織外觀，顯示明確的腎小球（G）、初級小管（PT）、遠端小管（DT）和小管間隙（TS=橢圓形）；B）0.05 mg/L：腎小球（G），TS直徑減?。?/span>#），TS擴張（*）；C） 0.2 mg/L：腎小管充血（CT）、腎小球（GN）、TS直徑減小（#）、變性小管（箭頭），以及TS擴張（*）；D）0.8 mg/L：腎小球壞死（GN），TS直徑減?。?/span>#），退行性小管（箭頭），小管間隙擴張（*），鮑曼囊擴張（+）；E）3.2 mg/L：腎小球壞死（GN），TS直徑減?。?/span>#），變性小管（箭頭），小管間隙擴張（*），鮑曼囊擴張（+）。

重金屬混合物對抗氧化脅迫的影響

與對照組相比，暴露組的活性氧（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）顯著增加，而總蛋白（TP）降低（圖4）。腎臟中的ROS生成比鰓更普遍，從暴露的第7天到第14天增加，但在第28天減少（圖4A）。HMs通過取代原始金屬離子結(jié)合蛋白質(zhì)基團的能力，導致酶失活和產(chǎn)生ROS（超氧自由基、羥基自由基和過氧化氫），這可能導致膜脂過氧化、基因組突變、酶活性降低、蛋白質(zhì)降解和氨基酸氧化。在第7天和第14天，SOD生成量沒有顯著增加，但在第28天增加（圖4B）。超氧化物歧化酶（SOD）有助于將過氧化氫轉(zhuǎn)化為氧氣和水，從而防止ROS積聚，ROS的減少和SOD水平的增加（圖4）表明魚類清除ROS和減少氧化損傷水平的能力更強。在所有暴露組中，丙二醛（MDA水平以時間和劑量依賴的方式增加（圖4C）。丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過氧化物（LPO）的一個指標，反映自由基損傷的程度。HMs可對細胞膜產(chǎn)生負面影響，從而通過LPO刺激改變生理學，ROS的形成使細胞MDA水平波動，MDA濃度增加與活性氧濃度下降相關。蛋白質(zhì)是魚類必需的能量來源，當受到壓力時，魚類可能通過氨基酸氧化利用更多的蛋白質(zhì)，總蛋白（TP）與MDA呈相反趨勢（圖4D）。在壓力下，由于食物攝入減少、組織修復、體內(nèi)平衡和解毒機制減少，蛋白質(zhì)水平可能會降低。隨著暴露時間和HMs濃度的增加，TP的減少與先前的研究類似。因此，高濃度的HMs會導致自由基的形成，從而增加損傷強度。

圖4 暴露7、14和28天后鰓和腎臟的氧化應激變化：A）活性氧（ROS）；B）超氧化物歧化酶（SOD）；C）丙二醛（MDA）；D）總蛋白（TP）。

腸道微生物群落組成的變化

腸道微生物群在維持生物體的健康、生長和發(fā)育中起著至關重要的作用，這些微生物群可能會受到各種環(huán)境因素的不平衡，因此在毒理學研究中很重要。在本研究中，對照組中門的相對豐度沒有顯著變化，但0.8 mg/L和3.2 mg/L組從第7天到第28天出現(xiàn)了極端變化（圖5A）。在第7天，0.8mg/L組以Fusobacteria（76.24%）為主，其次是Proteobacteria (12.38%)，Firmicutes(8.5%)， Bacteroidetes (1.59%)；在3.2mg/L組中，Proteobacteria百分比最高（82.45%），其次是Fusobacteria (8.61%)，Firmicutes (3.54%)，Bacteroidetes (3%)。在第14天，0.8mg/L組Proteobacteria（59.4%）增加，Fusobacteria（31.25%）減少，Firmicutes (6.99%) 和Bacteroidetes (2.07%)無明顯變化；3.2mg/L組除Firmicutes（99.16%）外，上述菌門均消失。在第28天，0.8 mg/L組的特征菌是Proteobacteria（49.94%）、Actinobacteria (40.95%)和Firmicutes (3.76%)，但Fusobacteria和Bacteroidetes消失（圖5A）。

暴露組的Firmicutes/Bacteroidetes比率受到干擾，這與先前的鯉魚暴露于Cu的研究結(jié)果一致。在第14天（3.2mg/L組），Firmicutes占大多數(shù)，因為腸道菌群豐度非常低（圖S2a），這一觀察結(jié)果可能表明，在極端Cr濃度下，Firmicutes是最具抗藥性的類群，但其它類群的耐受性有限。研究表明Firmicutes是一種碳水化合物發(fā)酵群，產(chǎn)生丁酸鹽，主要為上皮細胞和胃腸道細胞提供營養(yǎng)和能量，提高粘液產(chǎn)量，起到抗癌和抗炎作用，其耗盡可能會損害腸道屏障的完整性，因此，高比例的Firmicutes（圖5A）可能表明魚類需要通過保持腸道屏障功能來維持健康，而Bacteroidetes與營養(yǎng)吸收、上皮細胞成熟和維持有關。有研究表明在低Cu濃度（高達0.28 mg/L）下，發(fā)現(xiàn)鯉魚體內(nèi)主要存在Proteobacteria、Fusobacteria、Verrucomicrobia、Bacteroidetes，而尼羅羅非魚（1 mg/L Cd）中，分別在暴露8周和4周后，Bacteroidetes 和Proteobacteria占優(yōu)勢，這表明，在本研究中發(fā)現(xiàn)的腸道微生物群變化主要是由鉻（Cr）引起的，因為鉻主要被魚吸收（圖1）。在第28天，0.8 mg/L組出現(xiàn)Actinobacteria（圖5A），Actinobacteria可以產(chǎn)生對病原微生物有活性的次級代謝產(chǎn)物，它的出現(xiàn)可能表明該組中的魚易感染病原微生物。

在屬水平上，在對照組和0.8 mg/L（第7天和第14天）組中主要檢測到Cetobacterium，而在第14天3.2 mg/L組中，Lactococcus和Enterococcus普遍存在（圖5B）。Enterococcus和Lactococcus與Cr無顯著相關性，但與Cd、Cu呈正相關。相反，Bacteroides、Chitinibacter、Luteolibacter與Cr、Cd和Cu呈負相關（圖S3），表明它們在所有暴露組中消失（圖5B）。研究表明Cetobacterium和Lactococcus分別參與維生素B12的合成和葡萄糖發(fā)酵；Lactococcus在溫水（>20°C）和冷水（4-10°C）中可占優(yōu)勢，而Bacteroides可在腸道內(nèi)出現(xiàn)每日波動；Lactococcus產(chǎn)生細胞外產(chǎn)物，如乳酸、過氧化氫、二氧化碳、抗生素肽/蛋白質(zhì)和有機酸，以抵御潛在病原體。因此，上述數(shù)據(jù)表明，重金屬暴露導致腸道微生物失調(diào)，然而，益生菌可以通過腸道定植穩(wěn)定腸道微生物群來防止失調(diào)，潛在的益生菌，如Bacillus sp.和Enterococcus sp.，可顯著提高魚類的飼料利用率或轉(zhuǎn)化率、生長性能、免疫力、消化酶和抗氧化酶活性，以及抗病性。

圖5 對照組、0.8 mg/L和3.2 mg/L組在7、14和28天，重金屬暴露對腸道菌群的影響：a）在門水平鑒定的腸道微生物群的相對豐度；b）顯示屬水平的細菌熱圖。

在第7天，所有組共有70個OTU，而在第14天和第28天，所有組中分別共有72個和96個OTU（圖6A、B、C）。

圖6 維恩圖顯示了對照組、0.8 mg/L和3.2 mg/L組在7天（A）、14天（B）和28天（C）的特異和共有的OTUs。

目前的研究表明，重金屬（HMs）對魚類是有毒的，鉻（Cr）是其中毒性最大的。魚體內(nèi)高鉻的積累使其不適合人類食用。低濃度暴露會改變魚類的生物學參數(shù)，但長期高濃度暴露會導致死亡。重金屬吸收隨重金屬濃度的增加而增加。損傷程度隨著時間和重金屬劑量的增加而增加，引起極端的組織損傷、ROS生成和腸道微生物失調(diào)。高濃度重金屬混合物（0.8 mg/L和3.2 mg/L）對組織和腸道有害。3.2mg/L的混合液引起最大限度的ROS生成和腸道微生物失調(diào)。需要進一步研究重金屬混合物對魚類的影響，特別是腸道微生物的變化。未來的研究可以揭示重金屬在魚類中的毒性機制。