相對(duì)豐度會(huì)歪曲實(shí)際豐度，聯(lián)合16S擴(kuò)增子測(cè)序和總菌qPCR獲得的絕對(duì)豐度可靠嗎？

發(fā)稿時(shí)間：2020-06-02來(lái)源：天昊生物

英文題目: Complementing 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing with Total Bacterial Load To Infer Absolute Species Concentrations in the Vaginal Microbiome

中文題目：聯(lián)合16S擴(kuò)增子測(cè)序與總細(xì)菌負(fù)荷，推斷生殖道菌群物種的絕對(duì)豐度。

期刊名：mSystems

影響因子：6.519 

發(fā)表時(shí)間：2020年

發(fā)表單位：華盛頓大學(xué)弗雷德哈欽森癌癥研究中心疫苗和傳染病部

研究摘要:

盡管16S擴(kuò)增子測(cè)序可定量分析細(xì)菌類群的相對(duì)豐度，但樣品之間總細(xì)菌負(fù)荷的差異限制了其反映單個(gè)細(xì)菌物種絕對(duì)豐度的能力。qPCR可以定量單個(gè)物種的絕對(duì)豐度，但是針對(duì)存在于不同樣品中的每種細(xì)菌開(kāi)發(fā)一套qPCR檢測(cè)方法是不切實(shí)際的。我們想確定使用總細(xì)菌負(fù)荷和相對(duì)豐度相結(jié)合的方法來(lái)推斷細(xì)菌絕對(duì)豐度是否準(zhǔn)確可靠。我們分析了來(lái)自20名有細(xì)菌性生殖道病史的女性的1320份樣本，這些女性在60天內(nèi)每天自行收集生殖道拭子樣本。我們通過(guò)獲取物種相對(duì)豐度（通過(guò)16S擴(kuò)增子測(cè)序獲得）和總細(xì)菌載量（通過(guò)細(xì)菌16S通用引物 qPCR獲得）的乘積來(lái)推斷每個(gè)細(xì)菌的絕對(duì)豐度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Log ₁₀轉(zhuǎn)化得到的絕對(duì)豐度與七種特定細(xì)菌的特異引物靶向qPCR得到的絕對(duì)豐度相關(guān)。>0.5-log₁₀的誤差中有92％是由相對(duì)豐度低于10%的物種引起的，許多誤差發(fā)生在細(xì)菌從早期增殖或后期收縮到低豐度的過(guò)程中。當(dāng)一個(gè)物種的相對(duì)豐度大于10％時(shí)，基于兩種技術(shù)聯(lián)合推斷的絕對(duì)豐度是可以代替靶向qPCR的檢測(cè)結(jié)果。但是，靶向qPCR更適合檢測(cè)相對(duì)豐度低的細(xì)菌，并且對(duì)于表征單個(gè)物種的生長(zhǎng)和衰變動(dòng)力學(xué)靶向qPCR是第一選擇。

研究意義：

微生物組研究主要使用16S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序來(lái)評(píng)估細(xì)菌類群的相對(duì)豐度。但是16S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序不能準(zhǔn)確反映物種的絕對(duì)豐度。本研究試圖確定通過(guò)細(xì)菌16S通用引物 qPCR獲得總細(xì)菌載量和16S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序獲得的物種相對(duì)豐度的兩者乘積是否可以準(zhǔn)確地代替特異性qPCR所檢測(cè)的單個(gè)物種的絕對(duì)豐度?？傮w而言，基于兩種技術(shù)聯(lián)合推斷的特定物種的絕對(duì)豐度在某種程度上是物種特異性qPCR檢測(cè)結(jié)果的合理替代，尤其是當(dāng)細(xì)菌以較高的相對(duì)豐度存在時(shí)。這種方法提供了一個(gè)機(jī)會(huì)來(lái)評(píng)估細(xì)菌物種的絕對(duì)豐度，而無(wú)需為每個(gè)特定物種開(kāi)發(fā)單獨(dú)的qPCR分析方法。

研究背景:

對(duì)于大多數(shù)傳染病，單一病原體的絕對(duì)豐度通常是疾病嚴(yán)重程度和治療反應(yīng)的最具體標(biāo)志。相比之下，細(xì)菌群落的研究通常依賴于基于16S rRNA基因擴(kuò)增的NGS測(cè)序來(lái)評(píng)估細(xì)菌的相對(duì)數(shù)量，而非絕對(duì)數(shù)量。在機(jī)制層面上，細(xì)菌和細(xì)菌基因產(chǎn)物的特定組合被認(rèn)為在許多微生物相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，這種表征微生物群的方法很有價(jià)值。但是，與這些微生物分類群的相對(duì)豐度相比，單個(gè)細(xì)菌分類群的絕對(duì)豐度可能是疾病風(fēng)險(xiǎn)的更好預(yù)測(cè)指標(biāo)。使用qPCR定量單個(gè)物種的絕對(duì)豐度是很費(fèi)時(shí)的，不但要求使用已知濃度的內(nèi)標(biāo)DNA生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，而且價(jià)格昂貴，并且只能在專門實(shí)驗(yàn)室中使用；此外，每種qPCR分析都需要大量開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證成本，因此，qPCR不適合檢測(cè)群落中的所有物種的絕對(duì)豐度。此外，選擇最適合分析的物種可能反映出研究者的偏向性。

從NGS數(shù)據(jù)推斷多種細(xì)菌物種絕對(duì)豐度的方法未來(lái)在微生物組研究領(lǐng)域非常有用，包括生殖道微生物組的研究。擴(kuò)增子測(cè)序已用于幫助確定細(xì)菌性生殖道疾病，其它性傳播疾病以及早產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)增加的條件。然而，即使在一天的過(guò)程中，個(gè)體之間和個(gè)體內(nèi)部的總細(xì)菌負(fù)荷也可能隨著時(shí)間的推移而發(fā)生顯著變化，因此，相對(duì)豐度無(wú)法準(zhǔn)確代表絕對(duì)豐度，因此，最近腸道微生物組研究結(jié)果顯示，相對(duì)豐度可能會(huì)給出虛假的疾病關(guān)聯(lián)結(jié)果，而這些虛假的疾病關(guān)聯(lián)實(shí)際上可能是由不同個(gè)體間總微生物負(fù)荷差異所引起的。

在這里，我們證明了將相對(duì)豐度數(shù)據(jù)乘以通過(guò)qPCR測(cè)得的總細(xì)菌負(fù)荷所得到的推斷值，可以為每個(gè)樣品中特定物種的細(xì)絕對(duì)豐度提供有用的參考。在這里，我們通過(guò)與物種靶向qPCR測(cè)定的陰道微生物組中7個(gè)關(guān)鍵物種的絕對(duì)豐度相比較來(lái)驗(yàn)證上述推斷的絕對(duì)豐度估計(jì)值的準(zhǔn)確性。我們發(fā)現(xiàn)，雖然推斷的絕對(duì)豐度估計(jì)值對(duì)于大多數(shù)樣品都是準(zhǔn)確的，但當(dāng)物種的相對(duì)豐度較低時(shí)，這種聯(lián)合分析得到的推斷的絕對(duì)豐度估計(jì)值很容易出錯(cuò)，并且可能在從低細(xì)菌豐度增殖時(shí)期和后期收縮到低豐度的過(guò)程中可能會(huì)歪曲單個(gè)物種的動(dòng)力學(xué)。

研究結(jié)果：

縱向剖面的比較突出了相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度之間的差異

在研究過(guò)程中，我們比較了同一樣本的絕對(duì)濃度和相對(duì)豐度。圖1a和b顯示了單個(gè)參與者的細(xì)菌動(dòng)力學(xué)，所顯示的個(gè)體經(jīng)歷了細(xì)菌譜的動(dòng)態(tài)變化，并在低多樣性狀態(tài)到高多樣性狀態(tài)之間發(fā)生了顯著變化。

單一物種當(dāng)用qPCR檢測(cè)時(shí)，結(jié)果變化和擴(kuò)增子測(cè)序檢測(cè)結(jié)果變化不同，例如，對(duì)于圖1中所示的參與者，A. vaginae的絕對(duì)豐度在第17天（h 415）突然增加，但是相對(duì)豐度直到第28天（h 671），才顯示出突然增加。從第0天到第7天（h 168），受試者接受甲硝唑治療細(xì)菌性陰道炎（BV）： qPCR顯示BV相關(guān)物種的絕對(duì)豐度呈指數(shù)下降；然而，擴(kuò)增子測(cè)序則顯示受試者經(jīng)過(guò)治療更迅速地向Lactobacillus iners轉(zhuǎn)化。

另外，擴(kuò)增子測(cè)序的相對(duì)豐度也無(wú)法捕獲細(xì)菌的低水平定植，例如擴(kuò)增子測(cè)序在第6至11天（h 150和261）不能發(fā)現(xiàn)Gardnerella vaginalis的定殖，而靶向qPCR則可以發(fā)現(xiàn)Gardnerella vaginalis的定殖。如前所述，高多樣性狀態(tài)通常與Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, BVAB2, Megasphaera的高絕對(duì)豐度同時(shí)出現(xiàn)，這些都與細(xì)菌性陰道炎（BV）相關(guān)。

這些觀察結(jié)果強(qiáng)調(diào)靶向qPCR為測(cè)量單個(gè)物種的動(dòng)力學(xué)提供了更精準(zhǔn)的評(píng)價(jià)，而擴(kuò)增子測(cè)序是估計(jì)高多樣性群落中細(xì)菌多樣性的最佳方法。

圖1 參與者生殖道生態(tài)位的復(fù)雜細(xì)菌動(dòng)力學(xué)。對(duì)一名18歲女性每日采集的生殖道拭子樣本進(jìn)行分析：（a）針對(duì)七個(gè)特定物種的定向qPCR；（b）16S擴(kuò)增子測(cè)序；（c）相對(duì)豐度超過(guò)1%的物種的絕對(duì)豐度推斷值。方框表示已使用qPCR對(duì)特定菌進(jìn)行了檢測(cè)。推斷的絕對(duì)豐度比相對(duì)豐度更接近靶向qPCR檢測(cè)結(jié)果，并且可以預(yù)測(cè)無(wú)法進(jìn)行靶向qPCR檢測(cè)的物種的絕對(duì)豐度。

 

噪聲檢測(cè)分析表明采樣方差對(duì)觀察到的動(dòng)態(tài)影響有限

接下來(lái)，我們?cè)噲D評(píng)估觀察到的qPCR值變化是否是采樣或?qū)嶒?yàn)室可變性相關(guān)的噪聲造成的結(jié)果，而不是由于豐度的真實(shí)變化所致。我們從絕對(duì)豐度的縱向數(shù)據(jù)中估計(jì)采樣噪聲。該技術(shù)將數(shù)據(jù)分解為兩個(gè)部分：信號(hào)（樣品中的真實(shí)豐度）和噪聲，噪聲來(lái)源可能是生物學(xué)的，技術(shù)的，采樣的或這些的任意組合。在圖3a和b中，我們展示了兩個(gè)參與者的L.iners和BVAB2的縱剖面，我們發(fā)現(xiàn)檢測(cè)到的信號(hào)（紅色顯示）與qPCR測(cè)量數(shù)據(jù)（黑色顯示）非常接近，只有輕微的偏差，在所有其他參與者以及每個(gè)物種中都發(fā)現(xiàn)了相同的趨勢(shì)。在圖3c和d中，我們展示了檢測(cè)到的L.iners和BVAB2的噪聲在所有參與者中的分布，檢測(cè)到的噪聲平均值為零，方差很小，在細(xì)菌總數(shù)和所有其他物種中也發(fā)現(xiàn)了同樣的情況。

在我們的研究中，觀察到物種發(fā)生了高達(dá)8.2 log ₁₀的變化，細(xì)菌總負(fù)荷在60天內(nèi)可以改變4.9 log₁₀，這些觀察到的變化比我們估計(jì)的噪聲要大得多，這表明捕捉到的動(dòng)力學(xué)很可能是生物的，而不是噪聲。

圖3 噪聲檢測(cè)分析表明采樣方差很小，給出了兩個(gè)縱剖面的信號(hào)和噪聲分解，來(lái)自靶向qPCR分析的測(cè)量用黑色表示，由25%低通濾波器檢測(cè)到的信號(hào)用紅色表示，用于單獨(dú)參與者中的L.iners（a）和BVAB2（b）。在這兩種情況下，信號(hào)與絕對(duì)豐度測(cè)量值非常匹配。

 

推斷的絕對(duì)豐度是qPCR測(cè)量的絕對(duì)豐度的預(yù)測(cè)值

對(duì)于每個(gè)物種的絕對(duì)豐度，我們通過(guò)將細(xì)菌總負(fù)荷乘以擴(kuò)增子測(cè)序得到的相對(duì)豐度來(lái)推斷，如方程式1所示。然后，我們將推斷值與七個(gè)關(guān)鍵物種的靶向qPCR所測(cè)量的絕對(duì)豐度進(jìn)行了比較。對(duì)于每個(gè)物種，在大多數(shù)樣品中推斷出的細(xì)菌絕對(duì)豐度與qPCR所測(cè)量的絕對(duì)豐度很類似（圖1c；圖2中的虛線）。在許多情況下，對(duì)于大多數(shù)物種，沒(méi)有明顯的極端不一致（圖2a）。然而，對(duì)于某些物種，如Megasphaera和BVAB2，推斷的細(xì)菌絕對(duì)豐度始終高于qPCR所測(cè)量的絕對(duì)豐度一個(gè)數(shù)量級(jí)（圖2b）。在一組樣本中，對(duì)于所有物種，推斷的細(xì)菌絕對(duì)豐度為零，而qPCR水平為正，導(dǎo)致推斷的細(xì)菌絕對(duì)豐度和qPCR所測(cè)量的絕對(duì)豐度之間的嚴(yán)重不一致：這通常在低絕對(duì)豐度情況下出現(xiàn)（圖2）。

其中IC是推斷的絕對(duì)豐度，RA是相對(duì)豐度，TBL是細(xì)菌總負(fù)荷。

 

圖2 由于細(xì)菌總負(fù)荷的變化，相對(duì)豐度估計(jì)可能會(huì)歪曲實(shí)際豐度。兩名受試者中兩種不同物種的物種特異性特征的示例：crispatus，受試者06（a）和Megasphaera，受試者17（b）。垂直條顯示相對(duì)豐度（%，左y軸），實(shí)線表示qPCR測(cè)量的絕對(duì)豐度，灰色線表示細(xì)菌總負(fù)荷，虛線表示推斷豐度（右y軸）。黑色虛線表示qPCR數(shù)據(jù)的檢測(cè)閾值。箭頭表示相對(duì)豐度變化與絕對(duì)豐度變化不一致的時(shí)間點(diǎn)，這通常發(fā)生在細(xì)菌負(fù)荷急劇變化或相對(duì)豐度較低時(shí)。

 

我們比較了相對(duì)豐度和qPCR所測(cè)量的絕對(duì)豐度之間的相關(guān)系數(shù)（圖4a），還有就是推斷的絕對(duì)豐度和qPCR所測(cè)量的絕對(duì)豐度之間的相關(guān)系數(shù)（圖4b），結(jié)果發(fā)現(xiàn)與相對(duì)豐度相比，推斷的絕對(duì)豐度與qPCR所測(cè)量的絕對(duì)豐度的相關(guān)性略有改善。

圖4 與相對(duì)豐度相比，推斷的絕對(duì)豐度與qPCR所測(cè)量的絕對(duì)豐度的相關(guān)性略有改善。（a）絕對(duì)濃度與相對(duì)豐度的散點(diǎn)圖。（b）絕對(duì)濃度與推斷的絕對(duì)豐度的散點(diǎn)圖。

 

但是我們注意到物種間的相關(guān)性，在qPCR所測(cè)量的絕對(duì)豐度和推斷的絕對(duì)豐度之間的相關(guān)系數(shù)中，Megasphaera 和BVAB2的相關(guān)系數(shù)最強(qiáng)，其次是L. crispatus, A. vaginae和 L. jensenii。 G. vaginalis 和 L. iners的相關(guān)性最弱 （表1）。

表1單一物種的qPCR所測(cè)量的絕對(duì)豐度與相對(duì)豐度的相關(guān)系數(shù)，以及qPCR所測(cè)量的絕對(duì)豐度和推斷濃度之間的相關(guān)系數(shù) 。

 

我們定義推斷的絕對(duì)豐度為IC，如等式2所示。雖然推斷的絕對(duì)豐度誤差（IC error）的范圍很大（圖5a），但平均推斷的絕對(duì)豐度誤差和標(biāo)準(zhǔn)偏差較低。此外，在四分位范圍內(nèi)（IQR）的樣本中，大多數(shù)物種的推斷的絕對(duì)豐度誤差中位數(shù)接近于零，表明推斷的絕對(duì)豐度誤差很小（圖5a）。但是，對(duì)于BVAB2和Megasphaera，推斷的絕對(duì)豐度誤差的四分位范圍雖然很窄，但絕對(duì)豐度誤差都小于0，這意味著推斷的絕對(duì)豐度高估了其真實(shí)絕對(duì)豐度。使用推斷的絕對(duì)豐度，還有一種可能是低估了G. vaginalis的絕對(duì)豐度（圖5a）。

其中IC是推斷的絕對(duì)豐度，AC是絕對(duì)豐度。

 

圖5 與絕對(duì)豐度相比，較低的細(xì)菌相對(duì)豐度是推斷的絕對(duì)豐度誤差的主要預(yù)測(cè)因子。 （a）顯示推斷的絕對(duì)豐度誤差的箱式圖，其中推斷的絕對(duì)豐度為零，表明總體上誤差低；（b）相對(duì)豐度組的大于0.5的IC誤差的條形圖。黑色柱子包括雙重負(fù)數(shù)樣本（推斷的絕對(duì)豐度為零和qPCR所測(cè)量的絕對(duì)豐度為閾值）：大于0.5的IC誤差中93％由相對(duì)豐度低于10%的物種引起（85%是由相對(duì)豐度低于1%的物種引起的），灰色柱子是刪除了雙重負(fù)數(shù)樣本：在大于0.5的IC誤差中僅有85%是由相對(duì)豐度低于10%的物種引起的（66%是由相對(duì)豐度低于1%的物種引起的）；（c） 箱式圖顯示未確認(rèn)和確認(rèn)的總細(xì)菌載量被低估的樣品（通過(guò)16S通用引物qPCR測(cè)得的總細(xì)菌載量低于通過(guò)靶向qPCR測(cè)得的所有七個(gè)菌種絕對(duì)豐度的總和的樣本）的IC誤差。推斷豐度為零的數(shù)據(jù)點(diǎn)被刪除?？偧?xì)菌負(fù)荷被低估的樣品比其它樣品高估了單一物種的豐度。

 

低相對(duì)豐度是推斷的絕對(duì)豐度誤差的主要來(lái)源

結(jié)果顯示，特異性細(xì)菌相對(duì)豐度越低，推斷的絕對(duì)豐度誤差范圍越高（圖4b）。因此，在大于0.5的IC（推斷的絕對(duì)豐度）誤差中，93%是由相對(duì)豐度低于10%的物種引起的，85%是由相對(duì)豐度低于1%的物種引起的。這些IC誤差中有許多由這些雙重負(fù)數(shù)樣品（推斷的絕對(duì)豐度為零且qPCR所測(cè)量的絕對(duì)豐度為閾值的樣品）引起的，從分析中刪除這些樣品后，在大于0.5的IC誤差中，僅有85%是由相對(duì)豐度低于10%的物種引起的，僅有66%是由相對(duì)豐度低于1%的物種引起的（圖5b）。

當(dāng)qPCR檢測(cè)的絕對(duì)豐度值等于或低于檢測(cè)閾值時(shí)，我們將假陽(yáng)性樣本定義為非零推斷豐度值；當(dāng)qPCR檢測(cè)的絕對(duì)豐度值高于檢測(cè)閾值時(shí)，我們將假陰性樣本定義為零推斷豐度值。假陰性（23.6%）比假陽(yáng)性（3.17%）更為常見(jiàn)，說(shuō)明靶向qPCR比NGS更靈敏。不同物種間假陰性的發(fā)生率并不相同，其中G. vaginalis的假陰性率最高，其次是L. inners 和A. vaginae。一些物種的假陰性率較高，因?yàn)樗鼈兺ǔ３霈F(xiàn)在中等濃度下，接近相對(duì)豐度誤差閾值。假陰性樣本的qPCR中位數(shù)為3.92log₁₀（每個(gè)拭子16S rRNA基因拷貝數(shù)）（IQR，2.88到4.82；范圍，1.97到7.84），再次表明IC誤差通常發(fā)生在較低的細(xì)菌負(fù)荷下。

通過(guò)16S通用引物qPCR測(cè)得的總細(xì)菌載量通常低于通過(guò)靶向qPCR測(cè)得的所有七個(gè)菌種絕對(duì)豐度的總和，這些總細(xì)菌負(fù)荷被低估的樣品比其它樣品高估了單一物種的豐度（圖5c）。例如從這些細(xì)菌總負(fù)荷被低估的樣本中得出的非零推斷豐度為0.171 log₁₀（每個(gè)拭子16S rRNA基因拷貝數(shù)），平均IC誤差（IQR，-0.138至0.447；范圍為–7.31至2.66），而其它樣本的非零推斷豐度則為-0.368 log ₁₀（每個(gè)拭子16S rRNA基因拷貝數(shù)），平均IC誤差（IQR，為-0.638至-0.143；范圍為-6.54至1.42）。

L. crispatus的假陽(yáng)性率最高。 所有樣本中假陽(yáng)性的平均相對(duì)豐度非常低，為0.06％（IQR，0.04至0.11％；范圍，0.0007至36.8％）。

 

推斷的絕對(duì)豐度與樣品多樣性或測(cè)序深度無(wú)關(guān)

根據(jù)香農(nóng)多樣性指數(shù)（圖6a），樣品多樣性不影響推斷的絕對(duì)豐度（IC）誤差。此外，觀察到測(cè)序深度不影響推斷的絕對(duì)豐度（IC）誤差（圖6b），因此總的來(lái)說(shuō)，低細(xì)菌相對(duì)豐度是推斷的絕對(duì)豐度（IC）誤差的主要來(lái)源，而與多樣性或測(cè)序深度無(wú)關(guān)（圖6a和b）。在所有原始物種計(jì)數(shù)中均觀察到> 0.5的IC誤差，但最大的IC誤差（> 2）幾乎完全與100以下的原始物種計(jì)數(shù)相關(guān)（圖6c）。

圖6 樣品多樣性，測(cè)序深度和物種計(jì)數(shù)不影響推斷的絕對(duì)豐度（IC）誤差。（a）相對(duì)豐度與香農(nóng)多樣性指數(shù)。 較高的IC誤差主要發(fā)生在較低的相對(duì)豐度上，但在低和高多樣性樣本中均如此。（b）相對(duì)豐度與測(cè)序深度。 較高的IC誤差主要發(fā)生在較低的相對(duì)豐度下，但在測(cè)序深度的各個(gè)級(jí)別上均如此。（c）測(cè)序深度與物種數(shù)量。盡管在所有物種計(jì)數(shù)中觀察到的IC誤差約為0.5，但在物種數(shù)量低于100時(shí)發(fā)生了很高的IC誤差。

 

推斷的絕對(duì)豐度估計(jì)值可以預(yù)測(cè)單個(gè)物種細(xì)菌負(fù)荷的大多數(shù)時(shí)間變化

接下來(lái)，我們通過(guò)確定一天中細(xì)菌水平的變化來(lái)檢查推斷的絕對(duì)豐度是否是評(píng)估單個(gè)物種動(dòng)力學(xué)的有用工具。相對(duì)豐度的變化率與qPCR檢測(cè)的絕對(duì)豐度的變化率之間的相關(guān)性很弱，例如在23.2%的時(shí)間里，我們觀察到相對(duì)豐度的變化與絕對(duì)豐度的變化相反（見(jiàn)圖7a的左上和右下象限），這種類型的錯(cuò)誤通常發(fā)生在最豐富的物種(e.g., L. crispatus)和較稀有的物種（例如BVAB2）。

推斷的絕對(duì)豐度的變化率與qPCR檢測(cè)的絕對(duì)豐度的變化率則顯示出更好的相關(guān)性，例如推斷的絕對(duì)豐度將rIC誤差（推斷的絕對(duì)豐度引起的變化率誤差）降低了50％以上（從23.2降低到7.97％，圖7b）。

圖7 推斷的絕對(duì)豐度允許對(duì)兩個(gè)連續(xù)樣品之間的動(dòng)力學(xué)變化進(jìn)行某種程度的準(zhǔn)確推斷。（a）qPCR檢測(cè)的絕對(duì)豐度變化率與相對(duì)豐度變化率的散點(diǎn)圖顯示差的相關(guān)性。觀察到的相對(duì)豐度變化的很大一部分與絕對(duì)豐度的變化方向相反（左上和右下誤差象限標(biāo)有百分比）。（b）qPCR檢測(cè)的絕對(duì)豐度變化率與推斷的絕對(duì)豐度變化率的散點(diǎn)圖顯示出改善的相關(guān)性，百分比對(duì)應(yīng)于落在誤差象限內(nèi)且相對(duì)豐度較低的數(shù)據(jù)點(diǎn)。

 

圖8 顯示了A. vaginae絕對(duì)豐度水平和樣本間變化的典型輪廓，發(fā)現(xiàn)了數(shù)據(jù)中最常見(jiàn)的兩種類型的rIC誤差：第一個(gè)是當(dāng)兩個(gè)連續(xù)點(diǎn)之一推斷的絕對(duì)豐度為零（單陽(yáng)性）時(shí)會(huì)發(fā)生高的陽(yáng)性率或陰性率，這些點(diǎn)導(dǎo)致對(duì)所有樣本中單個(gè)物種的早期生長(zhǎng)率或后期收縮率的高估（圖7b和8b，右上象限和左下象限），當(dāng)細(xì)菌早期從低豐度增殖或后期收縮到低豐度的過(guò)程時(shí)，通常會(huì)發(fā)生此類rIC誤差。當(dāng)連續(xù)兩個(gè)點(diǎn)推斷的絕對(duì)豐度為零（雙陰性）時(shí)，就會(huì)發(fā)生第二種rIC誤差，導(dǎo)致低估了單個(gè)物種的早期生長(zhǎng)率或后期收縮率（圖8b），當(dāng)細(xì)菌早期從低豐度增殖或后期收縮到低豐度的過(guò)程時(shí)，通常也會(huì)發(fā)生此現(xiàn)象。這兩種rIC誤差占> 0.05 rIC誤差的91.7％（圖8c）。如果所有涉及零值的數(shù)據(jù)都從分析中消除，我們發(fā)現(xiàn)推斷的絕對(duì)豐度的變化率與qPCR檢測(cè)的絕對(duì)豐度的變化率之間存在極好的相關(guān)性（圖8b）。因此，當(dāng)細(xì)菌豐度較低或使用不太靈敏的16S通用引物PCR和NGS方法無(wú)法檢測(cè)到時(shí)，推斷的絕對(duì)豐度在微生物早期生長(zhǎng)或后期收縮不能捕獲準(zhǔn)確的動(dòng)力學(xué)。然而，當(dāng)細(xì)菌以較高的豐度存在時(shí)（例如每個(gè)拭子中的16S rRNA基因總拷貝數(shù)>10⁶），推斷的絕對(duì)豐度可用于估計(jì)單個(gè)物種的生長(zhǎng)率和收縮速率。

圖8推斷的絕對(duì)豐度可以準(zhǔn)確推斷兩個(gè)連續(xù)非陰性樣品之間的動(dòng)力學(xué)變化。（a，頂部）單個(gè)受試者A. vaginae隨時(shí)間變化（虛線表示推斷的絕對(duì)豐度，實(shí)線表示qPCR檢測(cè)的絕對(duì)豐度）；（a，底部）同一受試者A. vaginae隨時(shí)間變化的速率。只有當(dāng)一個(gè)連續(xù)樣本中的推斷的絕對(duì)豐度為零時(shí)，推斷的絕對(duì)豐度和qPCR檢測(cè)的絕對(duì)豐度之間的拭子-拭子水平差異才會(huì)變化。（b） 推斷的絕對(duì)豐度變化率與qPCR檢測(cè)的絕對(duì)豐度的散點(diǎn)圖。數(shù)據(jù)與圖7a和b中的數(shù)據(jù)相同，三角形對(duì)應(yīng)于圖a。根據(jù)連續(xù)樣本是雙陽(yáng)性（推斷的絕對(duì)豐度均>0推斷濃度）、單陽(yáng)性（推斷的絕對(duì)豐度一個(gè)>0和一個(gè)為0）還是雙陰性（推斷的絕對(duì)豐度均為0），對(duì)點(diǎn)進(jìn)行著色。兩個(gè)樣本都為正（不為零）的數(shù)據(jù)點(diǎn)的相關(guān)性要高得多。（c） 大多數(shù)rIC誤差>0.05發(fā)生在正、負(fù)樣本（單陽(yáng)性）之間的轉(zhuǎn)換過(guò)程中。