人SMN1/SMN2基因拷貝數(shù)檢測試劑盒

發(fā)稿時(shí)間：2020-03-18來源：天昊基因

背景介紹

脊髓性肌萎縮癥（Spinal Muscular Atrophy，SMA）是一種源于脊髓前角退變引起肌無力和肌萎縮的神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病，屬常染色體隱性遺傳病。活產(chǎn)嬰兒的發(fā)病率為I／6000～I／10 000，人群攜帶者頻率為1／40～1／50，居兒童致死性常染色體遺傳病的第2位。

根據(jù)發(fā)病年齡和進(jìn)程將SMA分為四種類型：嬰兒型（SMA I型），中間型（SMA II型），少年型（SMA III型）和成年型（SMA IV型）。四種類型SMA基因位點(diǎn)均在5號染色體上。運(yùn)動神經(jīng)元存活基因1（SMN1）的外顯子純合缺失（90-95%）或SMN1缺失/點(diǎn)突變（或部分缺失）（3~5%）的復(fù)合雜合突變是導(dǎo)致該疾病發(fā)生的主要原因。 SMN1: c.22dupA是中國人群報(bào)道頻率最高的點(diǎn)突變，在SMA病人中其頻率近1%。運(yùn)動神經(jīng)元存活基因2（SMN2）基因會轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生10-20%全長有功能的轉(zhuǎn)錄本，因此在SMA病人中，SMN2基因拷貝數(shù)與臨床表型嚴(yán)重程度密切相關(guān)，SMN2僅1拷貝96%可能是SMA I型，而SMN2>=4拷貝~90%可能是SMA III/IV型。有研究報(bào)道,在SMA病人中，SMN基因下游的神經(jīng)元凋亡抑制蛋白基因(NAIP)的缺失可能與更嚴(yán)重臨床表型相關(guān)。因此，基因檢測是確診SMA的金標(biāo)準(zhǔn)。      

產(chǎn)品介紹

用于人SMN1/SMN2基因拷貝數(shù)檢測。該檢測體系共設(shè)計(jì)16對探針，通過采集人基因組DNA，應(yīng)用公司自主研發(fā)且具有自主知識產(chǎn)權(quán)的AccuCopy^?多重熒光競爭性PCR （授權(quán)專利號：ZL201010180551.2，Du et al, 2012）與等位基因特異性熒光PCR技術(shù)組合，用于SMN1及SMN2基因的拷貝數(shù)檢測， 也可以檢測人基因組DNA中是否存在SMN1: c.22dupA突變以及NAIP基因的拷貝數(shù)，同時(shí)對SMN1基因可能存在部分外顯子（如E1-E4, E6-E8) 缺失給出提示。該檢測產(chǎn)品主要的開展領(lǐng)域?yàn)閶D產(chǎn)科，作為SMA的攜帶者篩查對所有備孕期或孕早期的夫婦進(jìn)行普篩，以及SMA攜帶者的優(yōu)生優(yōu)育指導(dǎo)和產(chǎn)前診斷，還可在神經(jīng)科用于SMA的確診、輔助判斷SMA的嚴(yán)重程度。

檢測內(nèi)容：

檢測SMN1、SMN2的拷貝數(shù)，并可對中國人高頻點(diǎn)突變SMN1 c.22dupA以及NAIP基因的拷貝數(shù)，及SMN1、SMN2的融合基因進(jìn)行檢測，并可對SMN1基因可能存在部分外顯子（如E1-E4, E6-E8) 缺失給出提示

產(chǎn)品優(yōu)勢

1、超高精準(zhǔn)檢測：采用天昊診斷公司自主研發(fā)且具有自主知識產(chǎn)權(quán)的拷貝數(shù)檢測技術(shù)AccuCopy?多重?zé)晒飧偁幮?/span>PCR進(jìn)行檢測，平均檢測CV<5%；

2、檢測范圍廣：可對SMN1及SMN2 8拷貝內(nèi)的變異進(jìn)行準(zhǔn)確檢測，還可對中國人高頻點(diǎn)突變SMN1 c.22dupA以及NAIP基因的拷貝數(shù)，及SMN1、SMN2的融合基因進(jìn)行檢測，并可對SMN1基因可能存在部分外顯子（如E1-E4, E6-E8) 缺失給出提示；

3、疾病判斷更精確： 加入SMN2、NAIP拷貝數(shù)檢測，更有利于輔助判斷SMA的嚴(yán)重程度；

4、使用范圍廣：可用于正常人群的SMA攜帶者篩查及SMA患者的基因診斷；

5、高效快速： 5小時(shí)之內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)，軟件自動精準(zhǔn)判讀結(jié)果；

技術(shù)原理：

通過取一定量的競爭性DNA片段混合物（每個(gè)競爭性DNA片段與各自對應(yīng)基因片段通常僅有2-3bp差別），然后與合適量的檢測樣本DNA混合，隨后利用多重?zé)晒?/span>PCR引物對檢測樣本DNA及競爭性DNA片段混合物進(jìn)行參照基因片段和目標(biāo)基因片段的擴(kuò)增；多重PCR產(chǎn)物經(jīng)熒光毛細(xì)管電泳后根據(jù)擴(kuò)增長度差異進(jìn)行分離，獲取不同基因片段的檢測樣本峰（S）以及競爭性DNA峰（C）的峰高值；分析每個(gè)基因片段的S/C峰高比值（稱R值），然后將目標(biāo)基因R值除以參照基因R值獲得RR值(用于校正不同檢測樣本DNA用量差異)，通過將檢測樣本的RR值除以參照樣本的RR值（用于校正不同基因片段對應(yīng)競爭性DNA的用量差異）后再乘以參照樣本在該目標(biāo)基因上的拷貝數(shù)即可獲得目標(biāo)基因的精確拷貝數(shù)。

 

技術(shù)對比：

檢測技術(shù)	位點(diǎn)數(shù)	檢測時(shí)間	部分缺失	操作	準(zhǔn)確性	樣本要求	結(jié)果判讀
qPCR	單反應(yīng)、單位點(diǎn)，單參照，位點(diǎn)之間不能相互校正，不能檢測更多的點(diǎn)突變和部分缺失	3小時(shí)	無法檢測	復(fù)雜（涉及到多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，否則假陽性率高）	低（無重復(fù)，假陽性、假陰性率較高，特別是對于攜帶者篩查；重復(fù)反應(yīng)，其CV約15-20%）	正常抽提樣本	標(biāo)準(zhǔn)化判讀
MLPA	多重位點(diǎn)，含多個(gè)參照位點(diǎn)，位點(diǎn)設(shè)計(jì)沒有針對國人突變的熱點(diǎn)	24小時(shí)	可以檢測	復(fù)雜（實(shí)驗(yàn)操作繁瑣，每次需至少5個(gè)對照）	中（一個(gè)經(jīng)典技術(shù)，平均CV保持在10%-20%）	樣本質(zhì)量要求高，同批次檢測樣本需相同試劑同批次抽提	軟件判讀，需要經(jīng)驗(yàn)
AccuCopy	多重位點(diǎn)，含3-4個(gè)參照位點(diǎn)；位點(diǎn)之間相互校正，有望新增10個(gè)突變位點(diǎn)	4小時(shí)	可以檢測	簡單（每次只需對照DNA及陰性對照各1個(gè)）	高（自主專利技術(shù)，位點(diǎn)之間相互校正，平均CV<5%）	正常抽提樣本	軟件自動化判讀，柱形圖使結(jié)果更加直觀

檢測流程

 

檢測效果

應(yīng)用AccuCopy^?多重熒光競爭性PCR與等位基因特異性熒光PCR技術(shù)檢測

 

正常樣本   SMN1=2   SMN2=2   NAIP=2

 

SMA攜帶者樣本   SMN1=1   SMN2=3   NAIP=1

 

SMA攜帶者樣本   SMN1=1   SMN2=1   NAIP=2

 

SMA患者樣本   SMN1=0   SMN2=3   NAIP=1

 

SMA患者樣本   SMN1=0   SMN2=2   NAIP=1

 

SMA患者樣本 SMN1=0   SMN2=4   NAIP=1

 

參考文獻(xiàn)

1. Du R, Lu C et al., Efficient typing of copy number variations in a segmental duplication-mediated rearrangement hotspot using multiplex competitive amplification. J hum Genet. 2012. 57(8):545-51

2. Ding Q，Wu X, et al., AccuCopy quantification combined with pre-amplification of long-distance PCR for fast analysis of intron 22 inversion in haemophilia A. Clin Chim Acta. 2016 458:78-83.

3. Liu B, Yang L, Huang B, et al. A functional copy-number variation in MAPKAPK2 predicts risk and prognosis of lung cancer[J]. Am J Hum Genet. 2012 Aug 10;91(2)：384-390.

4. Monani U R. Spinal muscular atrophy: a deficiency in a ubiquitous protein; a motor neuron-specific disease[J]. Neuron, 2005, 48(6): 885-895.

5. Sumner C J. Therapeutics development for spinal muscular atrophy[J]. NeuroRx, 2006, 3(2): 235-245.

6. Brzustowicz LM1, Lehner T, Castilla LH, Penchaszadeh GK, Wilhelmsen KC, Daniels R, Davies KE, Leppert M, Ziter F, Wood D, et al.Genetic mapping of chronic childhood-onset spinal muscular atrophy to chromosome 5q11.2-13.3. Nature. 1990 ,344(6266):540-1.

7. Su Y N, Hung C C, Lin S Y, et al. Carrier screening for spinal muscular atrophy (SMA) in 107,611 pregnant women during the period 2005–2009: a prospective population-based cohort study[J]. PloS one, 2011, 6(2): e17067.

8. Sugarman E A, Nagan N, Zhu H, et al. Pan-ethnic carrier screening and prenatal diagnosis for spinal muscular atrophy: clinical laboratory analysis of> 72 400 specimens[J]. European Journal of Human Genetics, 2012, 20(1): 27-32.