【昊閱讀】利用SSR標記分析古代銀杏群體的遺傳多樣性

發(fā)稿時間：2019-12-29來源：天昊生物

題目：Analysis of genetic diversity of ancient Ginkgo populations using SSR markers

發(fā)表期刊：Industrial Crops and Products  發(fā)表時間：2019-11-18  影響因子：4.191

 

銀杏（Ginkgo biloba L.）是一種著名的孑遺植物，也是銀杏綱唯一幸存的物種。為了探討銀杏地理種群的遺傳變異和冰川期可能避難所，研究者利用22個SSR標記對6個古種群和2個栽培種群的216份樣品進行了分析。在22個SSR位點共檢測到231個等位基因，平均預期雜合度(He)為0.808，表明遺傳多樣性水平較高。STRUCTURE、系統(tǒng)發(fā)育樹和主坐標(PCoA)分析結果表明，8個種群可分為2個類群，即東部類群(TM、NJ和PZ)和西南部類群(PX、DY、MJ、FG和WC)。東部組和西南部組分別有15個和14個獨特的等位基因。在這些群體中，來自東部的群體TM具有最高的遺傳多樣性和等位基因豐富度，在該群體中檢測到9個稀有等位基因和8個特異等位基因。雖然西南地區(qū)WC群體的遺傳多樣性低于TM群體，但在WC群體中發(fā)現(xiàn)了8個稀有等位基因和2個特異等位基因。據推測，東部的群體TM地區(qū)和西南部的群體WC地區(qū)是冰川期的避難所。此外，在來自東部的2個栽培種群中總共檢測到7個特異等位基因，這表明在冰川期期間可能還有其他避難所。

1、研究背景

銀杏作為一種“活化石”，是銀杏屬中唯一的物種。銀杏不僅是一種非常重要的藥用植物，還具有木材和觀賞用途。此外，銀杏因其起源早、生命力強，對植物物種起源和進化的科學研究非常有價值。然而，關于銀杏的起源，沒有確鑿的證據或公認的結論。侏羅紀時期銀杏科物種幾乎遍布全球，然而，隨著白堊紀晚期地球氣候的劇烈變化，銀杏樹屬物種開始減少。到第四紀冰川期開始時，冰川運動已經導致北美和歐洲所有銀杏滅絕。幸運的是，由于特殊的地形特征，中國的一些地方由于冰川侵蝕，成為銀杏的獨特避難所。然而，這些庇護所的數(shù)量和地點尚未得到確認。

在本研究中，研究者調查了分布在兩個潛在避難所的銀杏資源，并收集了古代種群。結合兩個人工林，利用SSR標記(1)了解這兩個潛在保護區(qū)的遺傳多樣性和種群間的關系；(2)探索銀杏在中國的可能起源和可能保護區(qū)。

 

2、材料和方法

植物材料

在中國西南部發(fā)現(xiàn)了五個古代種群(PX，DY，MJ，F(xiàn)G和WC)，而在中國東部只發(fā)現(xiàn)了一個古代種群(TM)。取樣樹之間的距離超過50 m，以降低取樣樹相關的概率(小種群除外)。為了比較古老種群和栽培種群之間的遺傳差異，從中國東部共選出兩個栽培種群(NJ和PZ)?？偣矎?個古代種群和2個種植園收集了216個個體。收集幼葉，用硅膠干燥，在-80℃保存?zhèn)溆?。每個群體的詳細信息見表1和圖1。

表1、銀杏種群相關信息

 圖1、銀杏8個種群的地理分布。PX，DY，MJ，F(xiàn)G，WC和TM是古代種群，NJ和PZ是栽培種群。

DNA提取及SSR標記基因分型

使用CTAB方法提取總基因組DNA。根據擴增的多態(tài)性、穩(wěn)定性和清晰度，從本實驗室開發(fā)的556個SSR標記中選擇了22個SSR標記，包括8個表達序列標記(E-SSR)和14個基因組標記(G-SSR) (表2)。使用ABI Veriti 96 PCR system (Thermo Fisher Scientific, MA, USA)對所有標記進行PCR擴增。使用96個毛細管3730xl DNA分析儀分離反應產物。

數(shù)據分析

對于每個標記，使用Peak Scanner軟件(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)分析基因型結果，具有相同堿基大小的條帶用相同的大寫字母表示。使用POPGENE軟件測定觀察等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀察雜合性(Ho)、預期雜合性(He)、Nei多樣性指數(shù)(H)、遺傳變異指數(shù)(Fst)、基因流(Nm)和Hardy-Weinberg平衡評估值(通過卡方檢驗評估)。使用PowerMarker軟件進行多態(tài)性信息含量(PIC)的測定和基于neighbor-joining方法構建的系統(tǒng)發(fā)生樹。使用FSTAT軟件分析等位基因豐富度。分子方差分析(AMOVA)和主坐標分析(PCoA)使用GenAlEx軟件進行。

為了估計個體祖先，本文使用STRUCTURE軟件對八個樣本集(DY、MJ、FG、WC、PX、TM、NJ和PZ)進行貝葉斯聚類分析。對于每個K值(潛在祖先群體的數(shù)量，范圍從1到9(群體數(shù)量+ 1))，基于混合模型估計每個個體的遺傳祖先；估計是用馬爾可夫鏈蒙特卡羅(MCMC)方法獲得的，進行迭代100，000次及100，000次的burn-in。根據STRUCTURE HARVESTER中的Evanno方法確定了最佳K值。結果用CLUMPP和DISTRUCT繪制。

3、研究結果

遺傳多樣性

基于來自六個古老群體和兩個栽培群體的216個樣本，在22個SSR基因座共獲得231個等位基因(圖2)。每個SSR基因座的等位基因數(shù)從5到20不等，平均每個基因座有10.5個等位基因(表3)。總的來說，平均Ne、He和PIC分別為6.104、0.808和0.781，表明216個樣品含有高水平的遺傳多樣性。在22個SSR基因座中，E-SSR32基因座遺傳多樣性水平最低，Ne最小(2.386)，He最低(0.582)，PIC最低(0.565)。相比之下，G-SSR38基因座表現(xiàn)出最高的多樣性，因為該基因座具有最大的Ne (12.130)、He (0.920)和PIC (0.912)。然而，22個SSR位點的等位基因頻率明顯偏離哈迪-溫伯格平衡(P < 0.05)。

圖2、E-SSR32基因座位點的PCR產物分離圖譜。前四個 (從A到D)來自WC種群，后四個(從E到H)來自TM種群。

總的來說，六個古代和兩個栽培群體的遺傳多樣性沒有顯示出很大不同，這些群體的遺傳多樣性從高到低依次為TM、WC、PX、NJ、PZ、MJ、FG和DY。在八個群體中，He值高于Ho值，表明雜合子缺乏(表4)。在6個種群中，種群TM表現(xiàn)出最高的遺傳多樣性，群體DY的遺傳多樣性最低。西南地區(qū)古樹的遺傳多樣性(WC、PX、FG、DY和MJ)也是略不同于東部古樹的遺傳多樣性(TM)。

表4、8個群體22個SSR位點遺傳多樣性統(tǒng)計平均值。

遺傳變異和遺傳結構

八個銀杏群體的遺傳變異系數(shù)Fst為0.093，表明群體間的遺傳變異很小，這可能是由于群體間的平均基因流較高(Nm=2.427，表3)。AMOVA的結果揭示了區(qū)域間(西南和東部)、區(qū)域內和群體內群體間的顯著遺傳差異(表5)，但變異集中在群體內?？偟膩碚f，3%的變異發(fā)生在地理區(qū)域之間，10%和87%的變異分別發(fā)生在區(qū)域內和群體內的群體之間。

表3、22個微衛(wèi)星位點的多態(tài)性信息。

表5、來自8個種群的216個個體的AMOVA分析。

 

為了分析銀杏群體的遺傳結構，基于貝葉斯聚類模型分析了群體間的親緣關系。根據DK的結果，當DK處于最大值時，最佳的K值是2(圖3)。

圖3、聚類數(shù)(K)與相應的DK之間的關系圖。

當K為2時，來自六個古代群體和兩個栽培群體的216個樣本的遺傳信息來自兩個差異祖先群體(圖4a)。在K= 2時，中國西南部五個古代群體(PX、DY、MJ、FG和WC)的大部分遺傳信息來自同一個祖先群體(綠色)，而中國東部的TM和兩個栽培群體(NJ和PZ)的遺傳信息主要來自另一個祖先群體(紅色)。在K = 3和4時，來自東方的三個群體的大多數(shù)遺傳信息仍然來自相同的祖先群體，這表明

兩個栽培種群(NJ和PZ)的起源與種群TM密切相關。然而，在西南部的五個古代群體中發(fā)現(xiàn)了基因差異。在五個古老的種群中，WC和PX種群具有豐富的遺傳變異和起源的遺傳信息。DY和MJ群體中的大多數(shù)遺傳信息來源相似，與WC和PX群體也密切相關。另外，群體FG中的遺傳信息是WC和PX群體中遺傳信息的混合，表明群體FG的形成受兩個古老群體的影響。

結果表明，8個種群的216個樣本可分為2個類群(I組和II組)，這與種群結構分析的模式一致。東部的TM、NJ和PZ三個種群的大部分遺傳信息屬于第一組，而西北部的五個古種群的大部分遺傳信息屬于第二組。此外，PCoA的結果進一步驗證了系統(tǒng)發(fā)育樹和種群結構分析結果(圖4-C)?？傊?，根據遺傳數(shù)據，這六個古代和兩個栽培種群的起源明顯不同，這些種群被分為西南組(PX、WC、DY、MJ和FG)和東部組(TM、NJ和PZ)。

圖4、A)基于貝葉斯聚類模型的216個樣本群體遺傳結構，K = 2-4。B)基于Nei’s遺傳距離的鄰居連接樹。C) PCoA圖。結果表明，樣品可分為兩類。

稀有等位基因和特異等位基因

在種群擴張過程中，低頻等位基因比高頻等位基因更容易丟失，這使得低頻等位基因成為種群起源研究的重要基礎。一般來說，原始群體比正常群體含有更多稀有等位基因和(或)特異等位基因。在216個樣本中檢測到的231個等位基因的頻率范圍從0.0023到0.6319，平均為0.0952。22個SSR基因座的最小等位基因頻率在0.0023-0.0370之間，平均為0.0144。為了研究群體間的遺傳變異，分析了在兩個群體中檢測到的稀有等位基因和僅在一個群體中檢測到的特異等位基因(圖5)。在22個SSR位點檢測到18個稀有等位基因和17個特異等位基因。8個SSR位點具有稀有等位基因，其中279、183和354比其他位點含有更多的稀有等位基因。10個SSR位點中分布有特異的等位基因，在32個位點和8個位點分別檢測到4個和3個等位基因。除DY群體外，其他群體都含有稀有等位基因，WC (8)和TM (9)群體比其他群體(3–4)含有更多稀有等位基因。四個群體(WC、TM、PZ和NJ)具有獨特的等位基因，而群體TM具有最獨特的等位基因(8)，其次是新澤西州(6)、華盛頓(2)和PZ (1)。值得注意的是，盡管西南方的WC種群幾乎沒有特異的等位基因，但西南方的五個種群有14個等位基因在東部種群中未檢測到(表6)，這表明西南方的古種群包含特異的遺傳信息。

圖5、8個銀杏群體中稀有和獨特等位基因的數(shù)量。

表6、西南5個群體中14個等位基因的頻率。

 

4、討論及結論

遺傳多樣性作為衡量一個物種適應環(huán)境變化能力的重要指標，受到許多因素的影響，如選擇、遺傳漂變、遷移和繁殖系統(tǒng)。研究銀杏種群的遺傳多樣性，為銀杏資源的保護和利用提供理論參考。

中國西南部位于青藏高原東南部和云貴高原，高原形成天然屏障，有效的減緩了冰期西伯利亞寒流對該地區(qū)的影響。由于其穩(wěn)定的環(huán)境和多樣的地貌，該地區(qū)擁有中國最豐富的生物多樣性。本研究樣本來自中國兩個公認的潛在避難區(qū)，具有遺傳多樣性，等位基因罕見且獨特。因此，這些樹木是重要的遺傳資源，可用于次級代謝產物的樹木育種過程。然而，除FG和TM種群外，各種群的雌雄樹比例均呈現(xiàn)不同程度的不平衡，雌樹數(shù)量是雄樹數(shù)量的2-6倍。DY、FG和MJ種群中的古樹不到20棵，這些種群中的古樹數(shù)量遠遠低于其他古種群。此外，22個SSR位點的所有等位基因均明顯偏離哈迪-溫伯格平衡，所有古代群體均表現(xiàn)出純合子過量。因此，西南和東部的古銀杏種群受到人類活動和自然因素的影響，應更加重視這兩個地方的古銀杏保護。

這項研究的結果證實，分布在兩個潛在避難所(西南和東部)的古銀杏種群具有高度的遺傳多樣性。兩地樣品間也發(fā)現(xiàn)了遺傳變異，西南地區(qū)的種群起源明顯不同，而東部種群起源明顯。在冰河時期，東部的種群總數(shù)和西南部的種群總數(shù)是兩個獨立的避難所，中國可能還有其他避難所。此外，古代種群受到人類活動和自然因素的影響，應該進一步保護。該研究不僅為銀杏避難所的研究提供了分子證據，也為古樹的開發(fā)利用提供了理論指導。

 

關于天昊：

天昊生物可以提供SSR分子標記的一代毛細管電泳檢測，并且基于二代高通量測序技術開發(fā)出SSRseq^TM專利技術, 可以根據客戶項目需求，提供不同數(shù)量樣本和位點的高性價比SSR檢測服務。

 

我們期待成為您SSR分型檢測的優(yōu)質服務合作伙伴，歡迎聯(lián)系我們具體咨詢！郵箱：techsupport@geneskies.com 電話：400-065-6886