在本研究中，所有母羊(湖羊和小尾寒羊)在相同的管理條件下飼養(yǎng)，并于2014年9月至12月交配，2015年2月至4月，采集了957只母羊血樣并記錄已產(chǎn)仔數(shù)，其中湖羊537只，小尾寒羊420只。本實驗流程如圖2所示，湖羊和小尾寒羊產(chǎn)仔數(shù)記錄表型數(shù)據(jù)如圖3所示。湖羊的產(chǎn)仔數(shù)從1到5只不等，小尾寒羊從1到4只不等。湖羊和小尾寒羊的平均產(chǎn)仔數(shù)分別為2.21和1.93?；蚪MDNA用苯酚-氯仿法提取，然后溶解在雙蒸水中，在-20℃儲存。

圖2、實驗方案示意圖

圖3、湖羊和小尾寒羊產(chǎn)仔數(shù)的頻率分布

SNP檢測和基因分型

總共為兩個綿羊品種構(gòu)建了10個DNA池，每個DNA池由10只個體組成，以鑒定所分析的10個基因中的潛在SNPs。如表1所述，這些個體是在所有不同的產(chǎn)仔數(shù)之間隨機選擇?？偣苍O(shè)計了119對引物來擴增每個基因的所有外顯子和側(cè)翼區(qū)域，對PCR產(chǎn)物進行測序，通過對序列進行比較來檢測可能的SNPs。所鑒定的SNPs通過天昊生物SNPscan^?高通量SNP分型技術(shù)分別進行基因分型，該方法基于連接酶連接和多重熒光PCR反應(yīng)進行。從957個樣品中隨機選擇三個DNA樣品進行兩次基因型鑒定，兩個空白樣品(ddH2O)用于消除交叉污染。

表1、每個DNA池中的樣本構(gòu)成在不同的產(chǎn)仔數(shù)之間維持平衡

群體參數(shù)計算與數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

利用SnpReady R包用于計算等位基因頻率、次要等位基因頻率(MAF)、多態(tài)信息含量(PIC)、預(yù)期雜合性(He)和觀察雜合性(Ho)，并進行Hardy–Weinberg平衡檢驗。如果MAF < 0.05和/或嚴重偏離哈迪-溫伯格平衡(p < 0.001)，則對這些SNPs進行排除不再進行進一步分析。

SNP關(guān)聯(lián)分析

使用線性模型來對單個SNP和每個綿羊品種產(chǎn)仔數(shù)的影響進行檢驗：L = 1n m + G + e

，其中L是產(chǎn)仔數(shù)的n × 1向量(湖羊，n = 537小尾寒羊，n = 420)，1n是所有元素等于1的n × 1向量，μ是總體平均值，G是對應(yīng)于SNPs的固定效應(yīng)，e是隨機剩余效應(yīng)的n × 1向量?；蛐烷g平均產(chǎn)仔數(shù)的差異用R包中的LSD最小二乘法檢驗。P < 0.05被認為是顯著的。P < 0.01被認為是非常顯著的。Bonferroni校正用于基因型組之間的多重測試。

單體型分析

在目前的研究中，只有每個綿羊品種同一基因中顯著關(guān)聯(lián)的SNPs被用來估計連鎖不平衡和單體型區(qū)塊的程度。湖羊的兩個顯著的SNPs和小尾寒羊的四個顯著的SNPs滿足這一前提，并且使用Haploview 4.2軟件估計顯著SNPs對和單體型區(qū)塊之間的LD程度。

研究結(jié)果：

基因分型和數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

通過DNA混池測序，在9個候選基因(除了NOG)中共鑒定出78個潛在的SNPs。

補充材料、10個候選基因中78個鑒定SNPs的信息（部分）

在評估引物后，78個單核苷酸多態(tài)性中的50個使用SNPs掃描方法進行了基因分型。在兩個空白樣品中檢測到三對技術(shù)重復(fù)的基因型相關(guān)系數(shù)等于1且沒有基因型信號，表明SNPscan^?高通量SNP分型技術(shù)方法是可靠的。排除MAF < 0.05和/或嚴重偏離哈迪-溫伯格平衡(p < 0.001)的8個湖羊SNPs和6個小尾寒羊SNPs，最后總共42個湖羊SNPs和44個小尾寒羊SNPs被用于進一步分析(表2)。

表2、湖羊(HUS)42個SNPs和小尾寒羊(STH)44個SNPs的群體遺傳參數(shù)表（部分）

注：MA：次要等位基因；MAF：次要等位基因頻率；PIC：多態(tài)信息內(nèi)容；He：預(yù)期雜合性；Ho：觀察雜合性；x²和p值表示哈迪-溫伯格平衡檢驗的卡方值和p值；“-”表示信息不可用。

與產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的SNPs

表3詳細說明了檢測的SNPs和產(chǎn)仔數(shù)之間的顯著關(guān)聯(lián)性。單個SNP關(guān)聯(lián)分析表明，湖羊的3個SNPs及小尾寒羊的4個SNPs是與產(chǎn)仔數(shù)顯著相關(guān)的，另外小尾寒羊中有2個SNPs是與產(chǎn)仔數(shù)為極顯著相關(guān)。其余36個SNPs與產(chǎn)仔數(shù)無顯著相關(guān)性。

表3、湖羊和小尾寒羊9個SNPs與產(chǎn)仔數(shù)的關(guān)系（部分）

.

9個重要的SNPs被映射到綿羊QTL數(shù)據(jù)庫(https://www.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/OA/index)，以更好地理解這些SNPs的潛在作用。9個SNPs被定位到13個與產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的數(shù)量性狀位點(表4)。SNPs和QTL之間的最近距離為1.8 Mb。

表4、湖羊和小尾寒羊與產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的9個顯著相關(guān)SNPs的數(shù)量性狀位點注釋

單體型分析

D′(r²)值是LD的一個指標，在本研究中進行了計算。D′(r²)分別為0.72 (0.34)和0.30 (0.04)，表明湖羊有2個SNPs (ADAMTS1: g.127753565T>C和ADAMTS1:g.127754640T>G) (圖4A)和小尾寒羊有2個SNPs (NCOA1: g.31928165C>T和NCOA1:g.32140565G>A)(圖4B)都并不緊密連鎖。而小尾寒羊中的2個SNPs (LIFR:g.35862868C>T和LIFR: g.35862947G>T))是緊密連鎖的(圖4C，D′和r²分別為0.97和0.84)。在小尾寒羊中鑒定出一個單倍型區(qū)塊(圖4C)，其中四個不同的單倍型是H1 (CG)、H2 (TT)、H3 (CT)和H4 (TG)。單體型頻率最高的是H1，占所有單體型的48.7%。H2是第二大比例，為47.1%，緊隨其后的是H3 (3.7%)和H4 (0.5%)(圖5)。由于低頻率的單倍型在統(tǒng)計分析中沒有意義，H4被排除在后續(xù)分析之外。關(guān)聯(lián)分析表明，單體型組合與小尾寒羊的產(chǎn)仔數(shù)顯著相關(guān)(表5)。H2H3 (CTTT)、H2H2 (TTTT)、H1H2(CTGT)個體的產(chǎn)仔數(shù)大于H1H1 (CCGG)個體。

圖4、ADAMTS1 (A)、NCOA1 (B)和LIFR (C)基因中顯著性SNPs的連鎖不平衡模式圖。紅色表示連鎖不平衡程度(D’值)

圖5、小尾寒羊兩個基因座（LIFR: g.35862868C>T和 LIFR:g.35862947G>T)的單倍型頻率

表5、小尾寒羊單體型組合與產(chǎn)仔數(shù)的關(guān)系表

結(jié)論：

本研究系統(tǒng)地研究了10個基因中潛在的SNPs作為綿羊產(chǎn)仔數(shù)增加的候選標記。對6個基因中的9個SNPs (KIT:g.70199073A>G, KITLG: g.124520653G>C, ADAMTS1: g.127753565T>C, ADAMTS1: g.127754640G>T, NCOA1: g.31928165C>T, NCOA1: g.32140565G>A, LIFR: g.35862868C>T, LIFR: g.35862947G>T 和NGF: g.91795933T>C)和2個基因座單倍型分析表明，H2H3 (CTTT)組合單倍型在小尾寒羊中產(chǎn)仔數(shù)比其他組合單倍型多，這9個SNPs可作為小尾寒羊和湖羊群體遺傳標記。

昊技術(shù)：

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截止到2019年1月，天昊生物的SNP分型平臺共發(fā)表文章366篇，總影響因子1057分。除了SNP分型外，我們還提供動植物拷貝數(shù)變異（CNV）檢測服務(wù)，歡迎聯(lián)系我們具體咨詢！

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