喜訊！天昊生物16S擴(kuò)增子絕對定量測序項(xiàng)目文章再次登陸《Science of the Total Environment》

發(fā)稿時(shí)間：2019-12-03來源：天昊生物

中國科學(xué)院南京土壤所王輝研究員課題組與南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生科院崔中利教授課題組合作的研究成果近期發(fā)表在環(huán)境科學(xué)與生態(tài)學(xué)TOP期刊《Science of the Total Environment》上，研究成果發(fā)現(xiàn)長期施氮降低了捕食性粘細(xì)菌的相對豐度和絕對拷貝數(shù)，改變了土壤中粘細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。在這項(xiàng)研究中使用了天昊生物創(chuàng)新型的的微生物16S擴(kuò)增子絕對定量測序技術(shù)。在恭喜客戶發(fā)表文章同時(shí)，我們想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文題目：Long-term nitrogen application decreases the abundance and copy number of predatory myxobacteria and alters the myxobacterial community structure in the soil

中文題目：長期施氮降低了捕食性粘細(xì)菌的相對豐度和絕對拷貝數(shù)，改變了土壤中粘細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

期刊名：Science of the Total Environment 

影響因子： 5.589

研究概要：

粘細(xì)菌是一種具有特殊社會(huì)生活方式（Social lifestyle）的微生物捕食者，這種社會(huì)性細(xì)菌（Social bacteria）在細(xì)菌域是獨(dú)一無二的。這些捕食者在土壤微生物食物網(wǎng)中代謝活躍，具有驅(qū)動(dòng)土壤微生物種群的能力。然而，施肥處理對農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中捕食性粘細(xì)菌的影響常常被忽視。本文采用高通量絕對豐度定量方法，對湖南祁陽紅壤試驗(yàn)站施肥29年的農(nóng)田中的粘細(xì)菌相對豐度和絕對拷貝數(shù)進(jìn)行了研究。利用16S擴(kuò)增子絕對定量測序技術(shù)，共檢測到419個(gè)粘細(xì)菌OTUs，占細(xì)菌總豐度的0.25-2.70%。PCoA、ANOSIM和Manhattan analysis結(jié)果表明，施氮（N簇）和施豬糞（M簇）的粘細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異（p<0.05）。施加氮肥顯著降低了粘細(xì)菌的相對豐度、拷貝數(shù)、物種積累指數(shù)和Shannon指數(shù)（p<0.05）。UpSet plots結(jié)果表明，氮肥處理的粘細(xì)菌OTUs數(shù)量僅為豬糞（M）處理的24.4%，施氮造成低豐度粘細(xì)菌OTUs數(shù)量的減少。此外，網(wǎng)絡(luò)分析、RDA分析和隨機(jī)森林RF分析表明，粘細(xì)菌相對豐度和絕對拷貝數(shù)是預(yù)測土壤細(xì)菌群落和功能基因α-和β-多樣性的重要變量（P<0.05）。研究結(jié)果表明，施氮肥引起的土壤酸化是導(dǎo)致土壤粘細(xì)菌相對豐度和絕對拷貝數(shù)下降的最主要原因；粘細(xì)菌相對豐度和絕對拷貝數(shù)的變化與細(xì)菌的α-和β-多樣性指數(shù)的變化顯著相關(guān)，粘細(xì)菌群落的變化可能是影響整體微生物群落變化的重要因素。

研究背景：

捕食是影響生態(tài)系統(tǒng)群落結(jié)構(gòu)和功能的重要因素之一。捕食性細(xì)菌與土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)，粘細(xì)菌（myxococacales）是土壤生態(tài)系統(tǒng)中最常見（最豐富）的捕食性細(xì)菌。粘細(xì)菌可捕食土壤中的各類微生物，包括革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細(xì)菌和真菌。粘細(xì)菌棲息于各種各樣的環(huán)境中，如溫帶、熱帶雨林、北極苔原、沙漠、酸性土壤、海洋和其它鹽堿環(huán)境，但其主要分布在土壤中。粘細(xì)菌是重要的土著捕食性細(xì)菌，以各種土壤微生物（死亡或存活）為食。粘細(xì)菌目前分為3個(gè)亞目（Cytobacterineae、Sorangiineae、Nannocystineae），10個(gè)科，29個(gè)屬， 58個(gè)種。根據(jù)其不同的食性，粘細(xì)菌可分為兩類：第一類是溶菌類群，其中包括絕大多數(shù)可培養(yǎng)粘細(xì)菌，這些粘細(xì)菌被稱為微生物的微型掠食者，因?yàn)樗鼈兡軌蛴行У亟到馄渌?xì)菌甚至真菌細(xì)胞（活細(xì)胞和死細(xì)胞）。第二類是降解纖維素類群，目前包括兩個(gè)屬，即Sorangium和Byssovorax，它們不能直接以活細(xì)菌為食，但可以降解死細(xì)菌。事實(shí)上，粘細(xì)菌多樣性的研究已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展。一些研究人員通過測定菌落和子實(shí)體的數(shù)量來估計(jì)粘細(xì)菌的細(xì)胞密度，結(jié)果表明，英格蘭南部1g土壤中的溶菌粘細(xì)菌細(xì)胞數(shù)為2000～75000個(gè)，加拿大東南部1g土壤中的粘球菌和珊瑚球菌細(xì)胞數(shù)為1000～45000個(gè)。然而，這些研究通常只統(tǒng)計(jì)一個(gè)或幾個(gè)粘細(xì)菌屬，因此大大低估了粘細(xì)菌的數(shù)量。利用粘細(xì)菌特異性探針進(jìn)行雜交分析的研究表明，粘細(xì)菌占細(xì)菌群落的比例不到1%。用粘細(xì)菌特異性引物W1/802R（用于亞目Cystobacteraceae, SDUCV34）和917F/W6RC（用于Sorangiineae亞目，SDUSV678）對土壤樣品中粘細(xì)菌類群的豐度進(jìn)行了評價(jià)，結(jié)果表明，在土壤生態(tài)位上，粘細(xì)菌群落具有高度多樣性，幾乎包括所有可培養(yǎng)的粘菌科或?qū)?。然而這些引物并不是所有粘細(xì)菌的通用引物，其覆蓋率有待提高，特別是沒有針對Nannocystineae的特異性引物。粘細(xì)菌在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的細(xì)胞密度、狀態(tài)和功能需要進(jìn)一步研究，我們對施肥系統(tǒng)如何影響土壤粘細(xì)菌種群缺乏全面的了解。我們認(rèn)為利用通用引物對16S rRNA基因進(jìn)行高通量測序仍是研究粘細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)最直接、最有效的方法：首先，通用引物可以覆蓋廣泛的粘細(xì)菌種類；第二，增加高通量測序的深度可以產(chǎn)生足夠數(shù)量的粘細(xì)菌序列，同時(shí)提供關(guān)于每個(gè)粘細(xì)菌OTUs的豐度和拷貝數(shù)的信息；最后，16S rRNA高通量測序提供了一些功能預(yù)測信息。在本研究中，我們提出一種高通量絕對豐度測序（HAAQ）方法，利用人工合成的DNA內(nèi)標(biāo)（直接加入到土壤總DNA中）同時(shí)獲得土壤細(xì)菌群落的絕對豐度和相對豐度。

粘細(xì)菌是重要的捕食性細(xì)菌，是農(nóng)業(yè)土壤微生物食物鏈的重要參與者，加強(qiáng)對土壤生態(tài)中粘細(xì)菌群落的研究，對于了解粘細(xì)菌在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的地位和潛在作用具有指導(dǎo)意義。但是，目前關(guān)于長期施肥條件下農(nóng)業(yè)土壤中粘細(xì)菌的相對豐度和絕對豐度的報(bào)道仍很少。本研究以中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院紅壤試驗(yàn)站29年的試驗(yàn)田為研究對象，對粘細(xì)菌的多樣性進(jìn)行了研究，就以下幾個(gè)方面提出了一系列問題：顯著增加/減少土壤中粘細(xì)菌相對豐度和絕對拷貝數(shù)的因素（特別是與施肥有關(guān)的因素）是什么；粘細(xì)菌相對豐度和絕對拷貝數(shù)變化與土壤生態(tài)功能的關(guān)系是什么；粘細(xì)菌參與土壤微生物食物網(wǎng)的潛力及其與土壤微生物總體變化的顯著相關(guān)性能否通過數(shù)據(jù)分析預(yù)測。

研究方法：

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：

長期試驗(yàn)田于1990年在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院祁陽紅壤實(shí)驗(yàn)站建立，設(shè)計(jì)了12種常用施肥處理：1）不施肥對照（control, CK）； 2）氮化肥 （N）； 3）氮磷化肥 （NP）； 4）氮鉀化肥 （NK）；  5）磷鉀化肥 （PK）；6）氮磷鉀化肥 (NPK)；7）氮磷鉀化肥配施豬糞 (NPKM) ；8） 1.5倍用量的氮磷鉀化肥配施豬糞（1.5NPKM）；9）氮磷鉀化肥配施秸稈；10）氮磷鉀化肥配施豬糞+大豆輪作（NPKMR）；11）豬糞（M）；12）休耕（Nature）。每種處理共采集四個(gè)土壤樣品（生物學(xué)重復(fù)），隨機(jī)選擇三個(gè)樣本用于進(jìn)一步研究。

16S擴(kuò)增子絕對定量測序：

使用FastDNA^? SPIN Kit for soil (MP Biomedicals, Santa Ana, CA)提取土壤DNA，然后在上海天昊生物科技有限公司進(jìn)行16S擴(kuò)增子絕對定量測序（V4-V5區(qū)域）。

研究結(jié)果：

基于測序結(jié)果，419個(gè)OTUs被注釋為粘細(xì)菌，占所有細(xì)菌的0.25-2.70%。每g土壤中粘細(xì)菌細(xì)胞的平均數(shù)約為95994122（1,576,240-266,559,840）。每個(gè)土壤樣品中檢測到約277-3,825條粘細(xì)菌序列，平均2065個(gè)。每克土壤中的粘細(xì)菌OTUs平均拷貝數(shù)為229,063.8 (562.4-6,585,170)。419粘細(xì)菌OTUs，除No_rank和unassigned OTUs外，共分為3個(gè)亞目，10個(gè)科（100%已知科），29個(gè)屬（51.7%）。只檢測到4個(gè)屬于降解纖維素類群的 OTUs：3個(gè)Sorangium OTUs和1個(gè)Byssovorax OTU。根據(jù)OTUs的數(shù)量，科排名如下：unassigned粘細(xì)菌（141個(gè)，占33.6%）、No_rank粘細(xì)菌（90個(gè)；21.5%）、Cystobacteraceae（41個(gè)；9.8%）、Polyangiaceae（40個(gè)；9.5%）、Labilitrichaceae (31；7.4%)、Sandaracinaceae (19； 4.5%)（表S2）。根據(jù)每克土壤的拷貝數(shù)，科排名如下：unassigned粘細(xì)菌（23,429,213；占24.4%）、No_rank粘細(xì)菌（19,668,760；20.5%）、Cystobacteraceae (14,258,960；14.9%)、Labilitrichaceae (10,429,414；10.9%)、 Polyangiaceae (9,026,838；9.4%)、Haliangiaceae (5,874,967；6.1%)。

施肥處理對土壤性質(zhì)、土壤細(xì)菌群落α-多樣性和粘細(xì)菌群落的影響

土壤理化性質(zhì)測定結(jié)果表明，施用豬糞（M）的土壤pH、總氮、總磷、速效磷、速效鉀和有機(jī)質(zhì)含量均顯著高于施用N肥的土壤，而總鉀的情況則不同。經(jīng)LEfSe分析，在這12種施肥處理下，共有1115個(gè)細(xì)菌類群存在顯著差異（LDA>2，p<0.05），其中包括大量粘細(xì)菌和其潛在的獵物細(xì)菌。土壤微生物群落的ACE和Shannon指數(shù)因施用N肥（N、NP、NK、NPK和NPKS）而顯著降低。相似的結(jié)果表明，施氮顯著降低了粘細(xì)菌的相對豐度、拷貝數(shù)和細(xì)菌群落的總拷貝數(shù)?；谶@些指標(biāo)對豬糞（M）和N肥處理的一致響應(yīng)，進(jìn)行了一系列相關(guān)分析。結(jié)果表明，土壤pH、OM、TN、TP、AP、AK和土壤細(xì)菌群落α-多樣性指數(shù)與粘細(xì)菌相對豐度和拷貝數(shù)呈顯著正相關(guān)。

施肥處理對土壤粘細(xì)菌群落α-和β-多樣性的影響

選取419個(gè)粘細(xì)菌OTUs進(jìn)一步進(jìn)行粘細(xì)菌群落的α-多樣性、PCoA和ANOSIM分析，發(fā)現(xiàn)不同施肥處理間，尤其是N和M處理間，Shannon、Simpson和物種積累指數(shù)存在顯著差異。粘細(xì)菌的群落用Bray-Curtis距離劃分了三個(gè)主要簇（PCoA圖A、B，N簇、M簇和CK簇）。PCoA和ANOSIM（表1）結(jié)果表明，M和N施肥處理對粘細(xì)菌群落（相對豐度和拷貝數(shù)）相似性距離具有有顯著性影響，PK處理更類似于CK_簇樣品（圖1A，粘細(xì)菌相對豐度），而不是N_簇樣品（圖1B，粘細(xì)菌拷貝數(shù)），為了便于進(jìn)一步分析，將PK分類到CK簇。此外，粘細(xì)菌相對豐度和拷貝數(shù)的PCoA軸1呈顯著的線性相關(guān)關(guān)系（圖1C，p<0.001），施肥處理對粘細(xì)菌相對豐度和拷貝數(shù)的群落結(jié)構(gòu)影響相似。

圖1 施肥處理對土壤粘細(xì)菌群落相對豐度（A）和拷貝數(shù)（B）的影響，以及基于相對豐度與拷貝數(shù)PCoA 軸1的相關(guān)關(guān)系（C）。

表1  三種肥料處理組間的ANOSIM分析。

最高豐度的前100個(gè)粘細(xì)菌OTUs被定義為核心粘細(xì)菌OTUs，用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。核心OTUs占粘細(xì)菌相對豐度的86.82%，占419個(gè)OTUs拷貝數(shù)的85.19%。前100位OTUs覆蓋粘細(xì)菌的3個(gè)亞目和10個(gè)科，包括26個(gè)No_rank OTUs，19個(gè)unassigned OTUs，13個(gè)Polyan-giaceae OTUs，12個(gè)Labilitrichaceae OTUs和10個(gè)Cystobacteraceae OTUs等。幾種優(yōu)勢OTUs的相對豐度和絕對拷貝數(shù)均高于大多數(shù)其它OTUs，但其它OTUs的豐度和拷貝數(shù)相對均勻，這些優(yōu)勢OTUs在分類學(xué)上也被分為不同的科或?qū)?，例如OTU154、OTU159、OTU1818、OTU285、OTU1469和OTU61 （圖2）。

對所有419個(gè)粘細(xì)菌OTUs進(jìn)行指示物種分析，物種指標(biāo)分析顯示，CK聚類樣本中有46個(gè)指示OTUs，M聚類樣本中有64個(gè)指示OTUs，N聚類樣本中有9個(gè)指示OTUs。然而大多數(shù)指示OTUs不在前100（核心）OTUs中，圖2中僅繪制了13個(gè)核心指示OTUs，分別是屬于CK簇的OTU5432、OTU5651和OTU6121；屬于M簇的OTU1987、OTU3197、OTU2670、OTU1527、OTU790、OTU3150、OTU1426和OTU1024；屬于N簇的OTU9510和OTU10088。

圖2 粘細(xì)菌群落對CK、M、N簇土壤的響應(yīng)。彩色分類樹狀圖顯示核心粘細(xì)菌（TOP100 OTUs），按亞目著色。內(nèi)圈代表分類樹（按科著色）。綠色星表示對CK簇土壤有顯著響應(yīng)的指示OTUs，紅色星表示對M簇土壤有顯著響應(yīng)的指示OTUs，藍(lán)色星表示對N簇土壤有顯著響應(yīng)的指示OTUs。

采用LEfSe對3個(gè)簇中相對豐度和拷貝數(shù)均存在顯著差異的粘細(xì)菌進(jìn)行評價(jià)，我們選擇LDA得分高于2的細(xì)菌群進(jìn)行鑒別，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對豐度和拷貝數(shù)的LEfSe結(jié)果非常相似：相同的8個(gè)粘細(xì)菌科（除了No_rank）在不同的簇之間有顯著差異，只有少數(shù)物種的結(jié)果不太一致。M簇中有9個(gè)主要的粘細(xì)菌屬富集，分別是Kofleria, Myxococcus, Nannocystis, Sorangium, Enhygromyxa, Polyangium, Sandaracinus, Haliangium和No_rank粘細(xì)菌。在N簇土壤中富集的粘細(xì)菌屬有Anaeromyxobacter和 Vulgatibacter，CK簇土壤中富集的是Polyangium, Sorangium, Byssovorax, Phaselicystis。

粘細(xì)菌OTUs在M和N簇中的差異

通過按照分類法（科/屬）排列419個(gè)OTUs，并在曼哈頓圖中顯示N簇和M簇的相對豐度（圖3A）或絕對拷貝數(shù)（圖3B），來剖析觀察到的粘細(xì)菌群落變化，結(jié)果顯示，在N和M處理之間，粘細(xì)菌OTUs相對豐度或絕對拷貝數(shù)有顯著差異（圖3）。M組有189個(gè)OTUs（相對豐度）和229個(gè)OTUs（絕對拷貝數(shù)）富集，而N組只有48個(gè)（相對豐度）和52個(gè)OTUs（絕對拷貝數(shù)）富集，這些顯著富集的OTUs的相對豐度和絕對拷貝數(shù)高于大多數(shù)沒有顯著變化的OTUs（圖3A）。結(jié)果表明，施加M肥顯著增加了各科的優(yōu)勢粘細(xì)菌的相對豐度和絕對拷貝數(shù)，而一些稀有的粘細(xì)菌OTUs對M和N處理沒有明顯的響應(yīng)。

圖3 曼哈頓圖顯示了M處理土壤相對于N處理土壤中富集的粘細(xì)菌的相對豐度（A）和絕對拷貝數(shù)（B）。顯著富集的OTUs被描繪為填充三角形，顯著減少的OTUs被描繪為空心三角形，不顯著的OTUs被描繪為全圓。虛線對應(yīng)于p值=0.05顯著性閾值。每個(gè)點(diǎn)的顏色代表了OTU（科水平）的分類隸屬關(guān)系，每個(gè)點(diǎn)的大小對應(yīng)于36個(gè)土壤樣品中OTU的平均相對豐度或絕對拷貝數(shù)。

LEfSe和Manhattan（圖3）的分析結(jié)果表明，施用M肥顯著增加粘細(xì)菌OTUs的相對豐度或絕對拷貝數(shù)，而施用N肥則相反。選擇UpSet plots分析進(jìn)一步觀察施N肥或施M肥對粘細(xì)菌OTU豐度和群落的影響，為了簡化模型并減少變量數(shù)量，只選擇CK、N、NP、PK、NPK和M施肥處理用于UpSet plots分析。結(jié)果表明，M肥處理的粘細(xì)菌OTUs數(shù)量最高（291個(gè)，占419個(gè)OTU總數(shù)的69.5%），其次是CK（237個(gè)，56.6%）、PK（210個(gè)，50.1%）、NPK（97個(gè)，23.2%）、NP（80個(gè)，19.1%）和N（71個(gè)，16.9%）處理（圖4）， 施N處理粘細(xì)菌OTUs僅為M處理的24.4%。此外，M肥處理獨(dú)有的粘細(xì)菌OTUs數(shù)也最高（95；22.7%），其次是CK（19；4.5%）、PK（7；1.67%）、N（4）、NPK（1）和NP（0）處理。

散點(diǎn)圖顯示了這些樣品中所有粘細(xì)菌OTUs的OTU size（豐度信息）和分類學(xué)信息（科和屬）（圖4）。M肥處理所特有的95個(gè)OTUs豐度較低，說明大多數(shù)是罕見（稀有）的OTUs，然而6組共有OTUs的豐度高于M肥處理所特有的OTUs，這些共有OTUs中核心OTUs數(shù)目也多于M肥處理所特有的OTUs，結(jié)果表明施M肥增加了稀有粘細(xì)菌OTUs的數(shù)量，而施N肥則減少了稀有OTUs的數(shù)量。

圖4  UpSet結(jié)果顯示不同處理下粘細(xì)菌OTUs的關(guān)系。左面（紫色條）顯示每個(gè)處理粘細(xì)菌 OTUs的數(shù)量。矩陣中的黑圈表示交叉的處理集。M的單向交集（紅色）和所有6個(gè)處理的六向交集（藍(lán)色）。OTU豐度（OTUsize）：該OTU在所有樣品中的序列總數(shù)，可用于指示土壤樣品中每個(gè)OTU的平均豐度。

土壤性質(zhì)與粘細(xì)菌群落及功能的關(guān)系

通過RDA分析以了解OTUs水平的粘細(xì)菌群落（圖5A, B）和土壤功能結(jié)構(gòu)（圖5C, D）。依據(jù)蒙特卡羅檢驗(yàn)和方差膨脹因子共篩選出4-5個(gè)具有顯著性影響的參數(shù)，即pH、OM、TK、AP、AK、粘細(xì)菌豐度（圖5）。粘細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的RDA結(jié)果顯示N簇樣品可以與其它處理樣品區(qū)分開來，pH值解釋了最大的變異，解釋了19.69%（圖5A；相對豐度）和19.54%（圖5B；絕對拷貝數(shù)），而OM、AP、AK和TK含量解釋的變異逐漸減少（見表2）。在土壤功能結(jié)構(gòu)方面，粘細(xì)菌豐度解釋了土壤功能的最大變化，解釋了15.11%（表2；FAPROTAX）和23.47%（表2；KEGG）的變化。

圖5 基于粘細(xì)菌豐度（A）、粘細(xì)菌拷貝數(shù)（B）、FAPROTAX（C）和KEGG（D）的土壤樣品之間的RDA分析。圓圈表示CK聚類；三角形表示M聚類；正方形表示N聚類；樣本點(diǎn)的顏色表示12個(gè)施肥處理。

表2土壤參數(shù)和粘細(xì)菌豐度對粘細(xì)菌群落和土壤功能變異的貢獻(xiàn)

土壤粘細(xì)菌群落及KEGG功能的分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析

分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析已被廣泛應(yīng)用于研究土壤微生物與功能基因的相互作用。利用粘細(xì)菌（包括29個(gè)粘細(xì)菌屬）的豐度和KEGG功能建立共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果表明，在生成的網(wǎng)絡(luò)中只有粘細(xì)菌和粘細(xì)菌_No_rank的豐度與26個(gè)KEGG功能 共計(jì)28個(gè)節(jié)點(diǎn)，但在網(wǎng)絡(luò)中未發(fā)現(xiàn)其它粘細(xì)菌屬。粘細(xì)菌豐度在所有節(jié)點(diǎn)中具有最高的特征向量中心性（節(jié)點(diǎn)最大，圖5E），此外粘細(xì)菌豐度節(jié)點(diǎn)的其它中心度指數(shù)都相對較高(Table S7)。KEGG節(jié)點(diǎn)與粘細(xì)菌節(jié)點(diǎn)存在共現(xiàn)性（co-occurred），這些KEGG功能參與重要的能量代謝過程，如氨基酸相關(guān)酶、原核生物的碳固定途徑、嘌呤代謝、嘧啶代謝、核糖體和轉(zhuǎn)錄等（圖5E）。

圖5 粘細(xì)菌豐度與土壤功能的共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)分析（E，KEGG）。紅色節(jié)點(diǎn)標(biāo)簽表示粘細(xì)菌，藍(lán)色的節(jié)點(diǎn)標(biāo)簽表示KEGG代謝途徑，模塊隨機(jī)著色。紅色連接表示兩個(gè)單獨(dú)節(jié)點(diǎn)之間的顯著正相關(guān)，綠色連接表示負(fù)相關(guān)。

土壤細(xì)菌群落的潛在驅(qū)動(dòng)力及其功能

RF分析確定了土壤細(xì)菌群落α-和β-多樣性及其功能指標(biāo)的主要微生物預(yù)測因子（P<0.05；圖6）。粘細(xì)菌的豐度、拷貝數(shù)和pH值是解釋三種細(xì)菌群落α-和β-多樣性及其功能的最重要變量（圖6A、B、C）。這三個(gè)變量的MSE%值高于其它變量，相對較高的MSE%值表示相對更重要的變量。此外，TN是預(yù)測細(xì)菌群落和KEGG功能的重要變量（圖6A、B）。TN也是預(yù)測PCoA1的重要變量（P<0.05）。AP是預(yù)測Shannon指數(shù)的重要變量（P<0.05）。

圖6土壤理化對細(xì)菌群落（A），KEGG（B）和FAPROTAX（C）功能多樣性的貢獻(xiàn)。均方誤差值增加的百分比（MSE%）意味著這些預(yù)測值的重要性。紅色條表示顯著預(yù)測（p<0.05），黑色條表示不顯著預(yù)測。                                                                                                                                                                  

                                                                      常規(guī)擴(kuò)增子測序技術(shù)和qPCR技術(shù)技術(shù)痛點(diǎn)

常規(guī)16S擴(kuò)增子測序技術(shù)雖然其具有高通量，低花費(fèi)，可客觀還原菌群結(jié)構(gòu)及相對豐度比例的巨大優(yōu)勢，但是其是通過某一OTU分類單元的序列數(shù)所占總序列數(shù)的比值來獲得某個(gè)細(xì)菌的相對豐度比例信息，然而相對豐度信息不能反映樣本中物種真實(shí)的絕對豐度情況，例如微生物某一類群的相對豐度比例增加不一定真正是相應(yīng)微生物類群的絕對豐度增加，可能是其它微生物類群的絕對豐度減少是導(dǎo)致其在群落結(jié)構(gòu)中相對豐度比例的增長，因此常規(guī)16S擴(kuò)增子測序技術(shù)基于相對定量分析的錯(cuò)誤結(jié)果解釋可能導(dǎo)致假定的因果關(guān)系！

qPCR絕對定量技術(shù)雖然可以進(jìn)行物種絕對定量分析，但是qPCR定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果常常不穩(wěn)定，且特定物種qPCR需要設(shè)計(jì)特定引物，對引物特異性要求較高，且引物優(yōu)化難度較大，導(dǎo)致常規(guī)的qPCR絕對定量實(shí)驗(yàn)不再適用于組成較為復(fù)雜的環(huán)境樣本微生物絕對定量。此外，當(dāng)環(huán)境樣本中往往含有腐殖酸，這些腐殖酸會(huì)通過抑制酶的活性抑制PCR，從而影響qPCR對細(xì)菌拷貝數(shù)定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。

天昊微生物16S擴(kuò)增子絕對定量測序技術(shù)簡介

該技術(shù)是一種將qPCR絕對定量技術(shù)和常規(guī)16S擴(kuò)增子測序技術(shù)合二為一的技術(shù)，該技術(shù)不但可以進(jìn)行Alpha多樣性分析、群落組成分析、Beta多樣性分析、指標(biāo)和微生物相關(guān)性分析等常規(guī)16S擴(kuò)增子測序分析，關(guān)鍵可以解析樣本中總細(xì)菌的絕對拷貝數(shù)，還可以解析樣本中每個(gè)物種的絕對拷貝數(shù)，因而對微生態(tài)學(xué)內(nèi)許多懸而未決的問題具有進(jìn)一步闡明的潛力。此外，該技術(shù)進(jìn)行細(xì)菌拷貝數(shù)定量時(shí)，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線的內(nèi)標(biāo)和樣本DNA是在同一個(gè)樣本孔中一起進(jìn)行PCR反應(yīng)，所以PCR反應(yīng)效率相同，因此校正了腐殖酸對PCR的影響，避免了腐殖酸等PCR抑制物對樣品細(xì)菌16S拷貝數(shù)定量的影響，因此針對土壤、水體和淤泥等環(huán)境樣本，天昊生物16S擴(kuò)增子絕對定量測序技術(shù)計(jì)算得到的細(xì)菌16S拷貝數(shù)相對于qPCR更準(zhǔn)確。

天昊微生物16S擴(kuò)增子絕對定量測序技術(shù)應(yīng)用情況

目前天昊微生物16S擴(kuò)增子絕對定量測序技術(shù)平臺(tái)已經(jīng)完成項(xiàng)目百余個(gè)，合作單位包括中國科學(xué)院微生物研究所、中國科學(xué)院南京土壤研究所、中國科學(xué)院水生生物研究所、同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院、廈門大學(xué)環(huán)境與生態(tài)學(xué)院、中國農(nóng)業(yè)大學(xué)、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)、東北農(nóng)業(yè)大學(xué)、重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院、鹽城工學(xué)院、南京財(cái)經(jīng)大學(xué)、南京中醫(yī)藥大學(xué)、武漢大學(xué)中南醫(yī)院、新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院、山東大學(xué)齊魯醫(yī)院等多個(gè)單位，覆蓋環(huán)境土壤微生物，環(huán)境水體微生物和醫(yī)學(xué)腸道微生物等多個(gè)領(lǐng)域，利用該技術(shù)的項(xiàng)目文章成功陸續(xù)發(fā)表在環(huán)境科學(xué)與生態(tài)學(xué)TOP期刊《Science of the Total Environment》（IF= 5.589）和應(yīng)用化學(xué)1區(qū)期刊《Carbohydrate Polymers》（IF=6.044）上，目前該技術(shù)因其創(chuàng)新性、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性受到客戶的廣泛好評！ 天昊生物目前是國內(nèi)唯一一家提供 “微生物16S擴(kuò)增子絕對定量測序”技術(shù)的服務(wù)商，熱烈歡迎各位老師與我們交流溝通！