疾病全轉(zhuǎn)錄組測序分析和后續(xù)功能研究最新范例

發(fā)稿時間：2019-04-03來源：天昊生物

 

1、Endometriosis-related ceRNA network to identify predictive biomarkers of endometrial receptivity

題目：子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)ceRNA網(wǎng)絡用于識別子宮內(nèi)膜容受性的生物標志物預測

發(fā)表雜志：Epigenomics 影響因子：4.979  發(fā)表日期：2019-2

 

研究背景

子宮內(nèi)膜異位癥影響大約5-15%的育齡婦女，是一種良性婦科疾病，它與骨盆疼痛和不孕有關(guān)。因此，從研究胚胎植入失敗的機制中獲得的知識可能有助于制定具體的治療措施，優(yōu)化胚胎植入。特別是，子宮內(nèi)膜異位癥患者在位子宮內(nèi)膜在著床期間分子差異的發(fā)現(xiàn)代表著了解這種情況的發(fā)病機制以及開發(fā)治療子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)子宮內(nèi)膜容受性缺陷的新策略的重要一步。據(jù)報道lncRNAs的失調(diào)可能會影響子宮內(nèi)膜容受性。

ceRNA理論提出極大地擴展了人類基因組中的功能性遺傳信息，在病理狀況中發(fā)揮了重要作用。本研究的目的是構(gòu)建子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)的lncRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡，探索可能作為子宮內(nèi)膜容受性生物標志物的關(guān)鍵RNA。

研究方法

組織收集

共有16名女性不孕患者參加了這項研究。子宮內(nèi)膜活檢取自手術(shù)和組織學證實的子宮內(nèi)膜異位癥患者(n=8)和手術(shù)中發(fā)現(xiàn)無子宮內(nèi)膜異位癥的患者(n=8)。

實驗分析方法

RNA isolation and RNA-Seq analysis、immunohistochemistry、differentially expressed genes screening、ceRNA network analysis & construction、pathway analysis、topological analysis、key genes and key lncRNA–miRNA–mRNA subnetwork selection、bidirectional clustering。

研究結(jié)果

 

圖1、本研究技術(shù)路線圖

 

免疫組織化學

通過免疫組織化學判斷，ERα、PR-B和PR-A/B的表達模式在正常組和子宮內(nèi)膜異位癥組之間發(fā)生了變化。根據(jù)IRS測定，子宮內(nèi)膜異位癥患者在PR-A/B和PR-B受體方面表現(xiàn)出較低水平的上皮子宮內(nèi)膜表達。

子宮內(nèi)膜異位癥患者全轉(zhuǎn)錄組測序分析

與子宮內(nèi)膜異位癥組相比，正常組共檢測到767個mRNAs (181個上調(diào)和586個下調(diào))、231個mRNAs (99個上調(diào)和132個下調(diào))和45個mRNAs (11個上調(diào)和34個下調(diào))。火山圖和散點圖顯示了兩組之間lncRNA、mRNA和miRNA表達的變化。

 

圖2、火山圖顯示了正常人和患者間lncRNA、mRNA和miRNA差異表達情況

 

LncRNA–miRNA–mRNA關(guān)聯(lián)分析

為了預測lncRNAs作為miRNA靶的功能，重構(gòu)了lncRNAs、miRNAs和mRNAs之間的網(wǎng)絡，然后可視化。LncRNA–miRNA–mRNA網(wǎng)絡由155個lncRNA節(jié)點、132個mRNA節(jié)點、40個miRNA節(jié)點和463個邊緣組成。

通路分析

對上述ceRNA網(wǎng)絡中的DELs、DEMs和DEMs進行GO分類和KEGG途徑的富集分析，以推測差異表達RNA類型的潛在功能。GO分子功能分析確定了41個富集的GO項。KEGG通路、分析的結(jié)果表明，這些基因可能參與了 “氧化應激”、“L1和錨蛋白之間的相互作用”、“視黃醇代謝”和“藥物代謝”途徑等。

拓撲分析與關(guān)鍵基因的選擇

在通過DELs、DEMs和DEMs的拓撲分析來識別ceRNA網(wǎng)絡的中心節(jié)點的前25個基因中，重疊基因被選為ceRNA進一步分析的關(guān)鍵基因?；诓町惐磉_RNA的倍數(shù)變化，分層聚類分析揭示了正常組與子宮內(nèi)膜異位癥組樣本RNA表達的概況。

研究者使用12個關(guān)鍵RNA構(gòu)建了ceRNA子網(wǎng)。進一步發(fā)現(xiàn)與子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)的關(guān)鍵差異表達mRNAs與GO分析中的38條路徑和KEGG分析中的30條路徑相關(guān)，包括“蛻膜化”、“VEGF信號通路”、“TNF信號通路”和“卵巢類固醇生成”。

 

圖3、CeRNA子網(wǎng)12個基因情況。子網(wǎng)包括30個mRNAs (藍色節(jié)點)、26個mRNAs (綠色節(jié)點)和32個mRNAs (紅色節(jié)點)。虛線強調(diào)了可能在子宮內(nèi)膜容受性中起作用的注釋。

 

lncRNAs–mRNAs–miRNAs的共表達與功能預測

通過皮爾遜相關(guān)分析進一步選擇了ceRNA子網(wǎng)中包含的lncRNAs、miRNAs和mRNAs用于雙向聚類，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了兩個共表達模塊，包括模塊1的12個mRNA和模塊2的18個mRNAs。

 

圖4、模塊1(A)和模塊2(B)的lncRNA–mRNA/miRNA–mRNA共表達網(wǎng)絡

研究結(jié)論

在這里，研究者對子宮內(nèi)膜異位癥患者子宮內(nèi)膜容受性受損者進行了全轉(zhuǎn)錄組測序分析，探討了lncRNA在調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性中的作用以及ceRNA機制的功能，構(gòu)建了一個子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)的lncRNA-mRNA-miRNA調(diào)控網(wǎng)絡，探索可以作為指示子宮內(nèi)膜容受性的生物標志物的關(guān)鍵RNA。

 

2、lncRNA-ES3/miR-34c-5p/BMF axis is involved in regulating highglucose induced calcification/senescence of VSMCs

題目：lncRNA-ES3/miR-34c-5p/BMF軸參與調(diào)節(jié)高糖誘導的血管平滑肌細胞鈣化/衰老

發(fā)表雜志：Aging 影響因子：4.867  發(fā)表日期：2019-1

 

 

 

研究背景

血管老化在糖尿病患者中非常常見，它可以影響心血管疾病的閾值、進展、嚴重程度和預后。血管鈣化也是血管老化的一個重要表型，是糖尿病患者大血管并發(fā)癥的常見影響之一。然而，很少有報道研究高糖對血管平滑肌細胞鈣化/衰老的影響。此外，高糖誘導VSMC鈣化/衰老的機制仍不清楚。

研究方法

qRT-PCR、RNA interference、western blot analysis、luciferase reporter assay、RNA pull-down assay、RNA immunoprecipitation (RIP) assay。

 

研究結(jié)果

研究者發(fā)現(xiàn)在高糖誘導的HA-VSMCs鈣化/衰老過程中，miR-34c-5p的表達降低

為了證明miR-34c-5p是否參與調(diào)節(jié)HA-VSMCs的鈣化/衰老，分別使用增益和喪失功能的方法來過度表達或抑制miR-34c-5p的表達。MiR-34c-5p模擬物和抑制劑被轉(zhuǎn)染到HA-VSMCs中，以過度表達或抑制miR-34c-5p的表達。qRT-PCR結(jié)果顯示miR-34c-5p模擬物誘導miR-34c-5p水平增加約50倍，miR-34c-5p抑制劑顯著降低miR-34c-5p的表達，這些數(shù)據(jù)表明miR-34c-5p在HA-VSMCs的鈣化/衰老過程中起著負面作用。

 

lncRNA-ES3通過直接相互作用抑制miR-34c-5p的表達

生物信息學分析顯示miR-34c-5p和lncRNA-ES3之間存在一些互補位點。此外，qRT-PCR證實了用HG處理的HA-VSMCs中l(wèi)ncRNA-ES3的水平顯著升高。研究進一步探索miR- 34c-5p是否可以直接與lncRNA-ES3相互作用。通過Pull-down等實驗驗證miR-34c-5p序列可以與lncRNA-ES3高度結(jié)合。結(jié)果表明，lncRNA-ES3和miR-34c-5p可以在HA-VSMCs中相互結(jié)合。

 

BMF是miR-34c-5p的目標

生物信息學分析顯示，預測BMF的3’UTR區(qū)域包含miR-34c-5p的一些潛在結(jié)合位點。在培養(yǎng)的HA-VSMCs中，miR-34c-5p的過度表達顯著降低了BMF的mRNA和蛋白水平，而miR-34c-5p抑制劑它們則顯著增加。熒光素酶測定表明miR-34c-5p的強表達顯著抑制WT-BMF報告者的熒光素酶活性，而在miR-34c-5p過度表達后，Mut-BMF報告者的熒光素酶活性沒有觀察到變化。Western印跡進一步顯示，lncRNA-ES3的沉默能迅速抑制BMF表達。收集起來，這些數(shù)據(jù)表明BMF是miR-34c-5p的目標，lncRAN-ES3充當miR-34c-5p的ceRNA，調(diào)節(jié)HA-VSMCs中目標基因BMF的表達。

 

miR-34c-5p抑制HA- VSMCs的鈣化/衰老，而lncRNA-ES3和BMF促進HA-VSMCs的鈣化/衰老

為了探討miR-34c-5p在HA-VSMCs鈣化/衰老中的生物學作用，本文發(fā)現(xiàn)miR-34c-5p的過度表達減弱了HG誘導的HA-VSMCs鈣化，ALP活性、OC分泌、Runx2表達和礦化結(jié)節(jié)的形成。與此同時，p16和p21表達減少，SA-β-gal陽性細胞染色，證實用miR-34c-5p模擬物轉(zhuǎn)染的HA-VSMCs的衰老也明顯減輕。為了評價lncRNA-ES3和BMF對HA-VSMCs鈣化/衰老的影響，分別用sLNcRNA - ES3和siBMF抑制了lncRNA-ES3和BMF在HA-VSMCs中的表達。結(jié)果表明，lncRNA-ES3或BMF的沉默顯著減弱了高葡萄糖刺激的HA-VSMCs鈣化/衰老，這一點通過ALP活性、OC分泌、Runx2、p16和p21表達的降低、礦物質(zhì)化結(jié)節(jié)以及SA-β-gal陽性細胞的染色得到證實。綜上所述，這些結(jié)果表明miR-34c-5p下調(diào)與HA-VSMCs的鈣化/衰老有關(guān)，這一機制可能是由高糖誘導的HA-VSMCs中的lncRNA- ES3和BMF介導的。

 

圖5、miR-34c-5p抑制了HA-VSMCs的鈣化/衰老，而lncRNA-ES3和BMF促進了HA-VSMCs的鈣化/衰老。

 

研究結(jié)論：

在本研究中，研究者發(fā)現(xiàn)BMF是miR-34c-5p的靶基因，lncRNA-ES3也有miR-34c-5p的一些互補位點。通過探索lncRNA-ES3/miR-34c-5p/BMF在血管平滑肌細胞鈣化/衰老中的潛在作用和分子機制，為尿病血管衰老的潛在治療尋找靶點。

 

 

全轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)優(yōu)勢：

• rRNA去除建庫，保留了完整的RNA種類信息；
• 鏈特異性文庫，可以保留轉(zhuǎn)錄本的鏈信息，更準確地檢測反義RNA；
• 使用高通量測序，能夠獲得更加全面的RNA信息，包括低豐度的RNA；
• 通過測定的序列信息精確地分析不同類型RNA的表達豐度變化及其生物學功能；
• 分析同一樣本中的mRNA、lncRNA、miRNA和circRNA四種類型RNA，明確這些RNA之間的共表達和調(diào)控關(guān)系，揭示ceRNA調(diào)控機制。

 

關(guān)于天昊：

天昊生物具有豐富的轉(zhuǎn)錄組和全轉(zhuǎn)錄組測序經(jīng)驗，我們致力于為研究者提供高質(zhì)量的科研策略咨詢、實驗技術(shù)服務和遺傳數(shù)據(jù)分析服務，期待成為大家科研工作中的“昊”助手與“昊”伙伴。歡迎聯(lián)系我們具體咨詢！郵箱：techsupport@geneskies.com 電話：400-065-6886