天昊項目新文：參與Bt轉(zhuǎn)基因水稻秸稈分解的活性微生物研究

發(fā)稿時間：2019-03-19來源：天昊生物

南京農(nóng)業(yè)大學近期在《Applied Microbiology and Biotechnology》上發(fā)表了參與Bt水稻秸稈分解的活性微生物研究的文章。在這項研究中天昊生物有幸承擔了樣品的擴增子測序工作。在恭喜客戶又發(fā)表文章同時，我們想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文題目： Probing active microbes involved in Bt-containing rice straw decomposition

中文題目：參與Bt水稻秸稈分解的活性微生物研究

期刊名：Applied Microbiology and Biotechnology    

影響因子：3.34

研究概要：

轉(zhuǎn)基因蘇云金芽孢桿菌（Bt）水稻對害蟲的防護作用顯著，滿足了日益增長的食物和能源需求。許多研究已經(jīng)對Bt水稻對農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的影響進行了研究，但對于確定Bt水稻的存在如何影響和塑造微生物群落，特別是活性微生物的研究卻很少。穩(wěn)定同位素探測和高通量測序被用于檢測參與Bt秸稈分解過程中的活性微生物。與近等位線相比，Bt秸稈中總氮、總磷、總鉀、木質(zhì)素、纖維素和Cry1Ab毒素蛋白含量較高，這些化學差異對分解速率沒有影響，但對具有分解活性的微生物菌群落有顯著影響。在Bt秸稈的分解過程中，真菌的影響大于細菌。壤霉菌屬、地桿菌屬、細桿菌屬、糖霉菌屬和Kribbella是最具代表性的細菌屬（僅存在于Bt處理組，并在早期出現(xiàn)）；木霉是Bt秸稈分解過程中最具代表性的獨特真菌屬。通過相似指數(shù)計算和功能預測，發(fā)現(xiàn)Bt秸稈和非Bt秸稈處理的微生物類群和功能性狀存在顯著差異，這些結(jié)果表明，在微生物分解秸稈方面，Bt水稻對土壤微生物具有顯著而短暫的影響。

研究背景：

水稻是世界上主要的糧食作物，對轉(zhuǎn)基因水稻的開發(fā)已久，在水稻中引入外源基因有可能保持或提高產(chǎn)量，其中一個途徑是提高水稻對害蟲的抗性。轉(zhuǎn)基因蘇云金芽孢桿菌（Bt）水稻表達殺蟲蛋白，最早于1989年開發(fā)，這種轉(zhuǎn)基因水稻顯示出對害蟲的高度防護，從而減少了化學殺蟲劑的使用。然而，Bt水稻所含的Cry蛋白通過Bt水稻殘基和根系分泌物釋放到土壤中，因為微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的核心，這一現(xiàn)象是否對土壤微生物群落有著深遠的影響是至關(guān)重要的，此前已經(jīng)開展了廣泛的研究，以研究Bt作物對土壤生態(tài)系統(tǒng)的各種影響，但對于Bt水稻的存在如何影響和塑造微生物群落，人們的關(guān)注卻很少。據(jù)報道，用Bt稻秸和非Bt稻秸對水稻土進行早期改良，可培養(yǎng)的好氧菌、放線菌、真菌、厭氧發(fā)酵菌、反硝化菌、產(chǎn)氫產(chǎn)醋酸菌、產(chǎn)甲烷菌在水稻土中有一些偶然的、顯著的變化。同樣，在稻田根系分解早期，Bt水稻根與非Bt水稻根處理的真菌群落組成也存在顯著差異。然而，一些研究表明，Bt水稻的種植對土壤微生物群落的影響很小或沒有。以往的研究表明，在植物基因組中引入外源基因可能改變植物殘基的組成，進而影響有機質(zhì)分解和土壤養(yǎng)分循環(huán)。稻草可以直接返回農(nóng)田，也可以在堆肥后作為有機物返回，以提高土壤肥力。這些常見的農(nóng)業(yè)實踐將大大增加種植Bt水稻對土壤微生物的影響，因此，在評估Bt作物種植影響時應(yīng)更加關(guān)注Bt秸稈的影響。

積極利用Bt水稻碳資源的微生物不能與那些在土壤中分解遺傳有機物的微生物區(qū)別開來，甚至在使用常規(guī)方法（總DNA測序）時也不能與那些沒有生命的微生物區(qū)別開來。穩(wěn)定同位素探測（SIP）為鑒定消化特定底物的微生物并分析其在環(huán)境中的作用提供了一種與培養(yǎng)無關(guān)的方法。據(jù)報道， ¹³C脈沖示蹤結(jié)合磷脂脂肪酸（PLFA）分析表明對Bt水稻根際微生物群落組成無持續(xù)或不利影響。然而，采用¹³C脈沖追蹤標記結(jié)合克隆文庫的研究發(fā)現(xiàn)，Bt水稻根際存在一種修飾過的活性產(chǎn)甲烷古菌群落。對Bt水稻（甚至其它Bt作物）秸稈分解過程中的活性微生物相關(guān)研究較少。2007年，利用¹³C標記植物殘基進行了第一次DNA-SIP實驗，研究了小麥殘基的分解過程，采用等密度梯度超離心法從總提取DNA中提取¹³C標記的DNA，用于活性微生物的進一步分析。隨著高通量測序技術(shù)的推廣，與傳統(tǒng)的DGGE、T-RFLP等方法相比，可以在更高的分辨率和深度上探索微生物群落。DNA-SIP和高通量測序相結(jié)合的方法將為研究Bt水稻中的活性微生物提供新的視角。

本研究的目的是在水稻土中加入¹³C標記的Bt稻草，并對其降解過程中的活性細菌和真菌群落進行研究。將¹³C標記的Bt稻草與土壤均勻化，培養(yǎng)5周以上。為了更好地分析土壤中吸收¹³C標記的Bt稻草中碳的活性微生物動態(tài)，通過監(jiān)測土壤呼吸來校準采樣時間點。關(guān)于微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性，采用高通量測序技術(shù)對秸稈分解過程中活性微生物群落的動態(tài)特征進行了研究，同時利用PICRUSt和FUNGuild分別推斷細菌和真菌的功能。本研究探討了Bt水稻對微生物類群和功能的影響。為了確定Bt水稻對土壤微生物群落是否有深遠影響，本研究的重點關(guān)注兩個主要問題：（i）Bt水稻與其非轉(zhuǎn)基因親本之間在參與秸稈降解的活性微生物上存在無差異、微小差異或顯著差異？（ii）參與Bt稻草分解的活性微生物是什么？

MiSeq測序：細菌測序區(qū)段（V4-V5）； 真菌測序區(qū)段（ITS2）

研究結(jié)果：

Bt和非Bt秸稈的性能差異明顯

Bt秸稈總氮、總磷、總鉀、木質(zhì)素和纖維素含量高于非Bt秸稈，僅在Bt秸稈中檢測到Cry蛋白。本研究中bt和非bt秸稈中半纖維素的含量沒有顯著差異（表1）。

 

活性微生物群落組成在Bt和非Bt處理之間有顯著區(qū)別，并隨時間推移而變化

考慮到土壤呼吸的趨勢，添加秸稈后1周、3周和5周分別進行3次采樣。WK1（第一周）、WK3（第三周）和WK 5（第五周）分別定義為秸稈分解的早期、中期和后期。Bt處理和非Bt處理下土壤呼吸無顯著性差異。¹³C標記菌群的NMDS分析表明Bt和非Bt處理在垂直軸上存在差異，并根據(jù)不同的采樣時間在水平軸上產(chǎn)生連續(xù)的點（圖1a）。此外，PERMANOVA顯示¹³C標記細菌群落與轉(zhuǎn)基因和時間有顯著的相關(guān)性。¹³C標記的真菌群落的NMDS排序與細菌群落的NMDS排序相似（圖1b）。在細菌和真菌群落中，時間的影響遠遠大于轉(zhuǎn)基因的影響。

 

圖1基于Bray-Curtis相似指數(shù)的活性微生物群的NMDS排序。不同的顏色代表不同的處理和采樣時間點。A細菌群落,B真菌群落。

 

Bt和非Bt秸稈分解中的共享和獨特物種

Bt和非Bt秸稈處理共享部分類群，Streptomyces鏈霉菌是Bt和非Bt秸稈處理中最具優(yōu)勢和活性的一個屬（圖2a）。本研究所鑒定的五種鏈霉菌中，有一種（bOTU57）只存在于Bt秸稈處理中，其豐度相對較低。鏈霉菌的其他種類（bOTU1, bOTU2, bOTU4, bOTU5）在Bt和非Bt秸稈分解過程中均表現(xiàn)出很高的相對豐度，并存在于各個時期。然而，在Bt和非Bt秸稈處理下，這些共有的物種表現(xiàn)不同，它們要么隨時間逐漸增加或減少，要么只在某一時期存在，此外它們的相對豐度在不同的處理中也不同。此外，Xanthomonadales黃單胞菌屬的兩個溶菌屬（bOTU7 和 bOTU9）、一個Dyella sp.屬（bOTU12）和一個紅桿菌屬（bOTU6）以及一個Massilia屬（bOTU13）表現(xiàn)出與Streptomyces鏈霉菌相似的特性，盡管它們的相對豐度低于鏈霉菌屬。

Bt秸稈處理具有獨特的分類群，例如屬于Micrococcales微球菌的5個物種中有4個是Bt處理獨有的：2個農(nóng)桿菌屬（bOTU19和bOTU28）在整個培養(yǎng)過程中都存在，而地桿菌屬（bOTU18）和微桿菌屬（bOTU34）只存在于早期。除此之外，早期還存在糖酵母菌屬（bOTU62）和鏈霉菌屬（bOTU57）；早期和中期還存在Kribbella屬（bOTU16）；晚期還存在螯合球菌屬（bOTU24）。

相反一些類群只在非Bt秸稈處理下出現(xiàn)，例如，Vulgatibacter sp. (bOTU39)僅在早期存在。除此之外，Devosia sp. (bOTU44), Altererythrobacter sp. (bOTU31), 四個未分類群 (bOTU36, bOTU20, bOTU60, bOTU124)僅在中期出現(xiàn)。

 

 

圖2最具活性O(shè)UT聚類分析。不同的氣泡大小代表不同的豐度。優(yōu)勢共享類群以紅灰色標記，Bt秸稈處理獨特類群以藍灰色標記，非Bt秸稈處理獨特類群以黃灰色標記。標記的分類群共享的最高分類分辨率標記在氣泡圖的右側(cè)。A細菌群落。

真菌種類分布較均勻，主要是Ascomycota子囊菌屬和Mucoromycotina粘液菌屬（圖2b）。紫錐菌屬（fOTU 1）是Bt和非Bt秸稈處理最活躍的真菌類群。屬于Aspergillaceae曲霉科的3種Penicillium spp.青霉屬（fOTU13、fOTU25和fOTU54）和3種Aspergillus spp.曲霉屬（fOTU27、fOTU31和fOTU34）也被Bt和非Bt秸稈處理所共有，并且占據(jù)優(yōu)勢地位。

與細菌類群相似，一些真菌類群是Bt秸稈處理的特有類群。在早期階段，出現(xiàn)了Zopfiella sp. (fOTU32)，中期出現(xiàn)了Alternaria sp. (fOTU97)和Neonectria sp. (fOTU105)。值得注意的是，木霉菌Trichoderma sp. (fOTU128)在各個階段都存在。

相比之下，一些分類群Lichtheimia sp. (fOTU60)和兩個非分類種(fOTU122 and fOTU623)出現(xiàn)在后期，并且是非bt秸稈特有的。

 

圖2最具活性O(shè)UT聚類分析。不同的氣泡大小代表不同的豐度。優(yōu)勢共享類群以紅灰色標記，Bt秸稈處理獨特類群以藍灰色標記，非Bt秸稈處理獨特類群以黃灰色標記。標記的分類群共享的最高分類分辨率標記在氣泡圖的右側(cè)。B真菌群落。

Bt與非Bt秸稈處理后活性群落的相似性指數(shù)在后期有所增加。

所有與秸稈分解有關(guān)的微生物都被定義為labeled標記群落（或活性群落）。此外相對豐度大于1%的標記類群被認為是abundant豐富群落。根據(jù)Bray-Curtis距離，計算并比較了不同分解階段Bt和非Bt秸稈處理的labeled標記群落（圖3，右）和abundant豐富群落（圖3，左）的相似性指數(shù)。就abundant豐富群落而言，在細菌群落（圖3a）和真菌群落（圖3b）中Bt和非Bt處理之間的相似性隨時間而增加；在labeled標記群落方面，相似性下降，然后增加。最后，無論是labeled標記群落還是abundant豐富群落，Bt和非Bt秸稈處理細菌群落的相似性總是高于真菌。

 

圖3 Bt和非Bt秸稈處理后活性群落（豐富或標記群落）的相似性。A細菌群落的相似性, B真菌群落的相似性。

Bt和非Bt秸稈處理之間細菌功能相似但真菌功能不同

通過PICRUSt預測細菌功能，由于本研究的重點是秸稈分解，因此僅考慮與代謝相關(guān)的結(jié)果。無論是轉(zhuǎn)基因還是孵育時間預測結(jié)果都非常相似（圖4a），氨基酸代謝和碳水合物代謝是細菌最主要的功能。

圖4不同處理過程中活性微生物群落的預測功能。A細菌功能。

用FUNGuild預測真菌功能，與細菌功能不同，Bt和非Bt秸稈處理的真菌功能明顯不同，并隨時間變化（圖4b）。值得注意的是，Bt和非Bt秸稈處理之間真菌功能的相似性隨著時間的推移而增加。

 

圖4不同處理過程中活性微生物群落的預測功能。B真菌功能。

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