英文題目: Alterations in Gut Glutamate Metabolism Associated with Changes in Gut Microbiota Composition in Children with Autism Spectrum Disorder

中文題目：自閉癥兒童腸道谷氨酸代謝的變化與腸道微生物組成變化相關(guān)

期刊名：mSystems

影響因子： 5.750

發(fā)表單位：復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院

研究摘要: 

腸道微環(huán)境的變化可能影響自閉癥譜系障礙（ASD）的發(fā)病機(jī)制。在這里，我們調(diào)查了自閉癥兒童腸道微生物和代謝物的組成。92名自閉癥兒童（ASD）和42名典型發(fā)育（TD）的年齡匹配兒童被納入了兩階段研究。在發(fā)現(xiàn)階段，對43名ASD組兒童和31名TD組兒童的糞便樣本同時(shí)進(jìn)行了宏基因組測序和液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）分析，以確定與腸道微生物群組成改變相關(guān)的腸道代謝產(chǎn)物。在驗(yàn)證階段，使用LC-MS分別對ASD組（49名）和TD組（11名）兒童進(jìn)行代謝物檢測。ASD組的谷氨酸代謝產(chǎn)物發(fā)生了改變，伴隨2-酮-谷丙二酸含量下降與谷氨酸代謝相關(guān)的微生物數(shù)量增多。谷氨酸代謝的這些變化與較低水平的Bacteroides vulgatus和較高水平的潛在有害Eggerthella lenta，Clostridium botulinum有關(guān)。ASD組的腸道皮質(zhì)醇水平較低，與腸道微生物谷氨酸代謝的變化有關(guān)。最后，腸道2-酮-戊二酸被證實(shí)是一種潛在的ASD生物標(biāo)志物。自閉癥患兒腸道微環(huán)境的顯著變化可為自閉癥的病因提供新的認(rèn)識，并有助于尋找診斷和治療方法。

研究背景: 

自閉癥譜系障礙（ASD）影響美國2.24%的3-17歲兒童，目前尚無可行的實(shí)驗(yàn)室診斷或有效的治療方法。多種證據(jù)表明，腸道微生物群可能通過“腸-腦”軸在ASD發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，在ASD患者中，通過糞便微生物群移植（FMT）啟動的腸道環(huán)境變化可改善ASD的核心癥狀。事實(shí)上，在臨床試驗(yàn)中，18例ASD患者進(jìn)行開放式糞便移植后，18例患者中有16例（88.8%）的胃腸道問題有顯著改善，ASD的核心綜合征也顯著改善。在腸道代謝產(chǎn)物異常的ASD小鼠模型中，糞便移植可以糾正代謝產(chǎn)物異常并改善這些小鼠的行為異常。越來越多的研究表明，腸道代謝物在ASD中也起著重要作用。例如，ASD小鼠模型顯示代謝物4-乙基苯酚硫酸鹽水平顯著增加，可通過Bacteroides fragilis降低代謝物4-乙基苯酚硫酸鹽水平，而其它腸道代謝物，如源自微生物群的短鏈脂肪酸，可調(diào)節(jié)血-腦屏障通透性并影響動物行為。這些研究表明，ASD患者腸道微環(huán)境的變化可能在疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。然而，目前的研究大多集中在了解這些患者腸道微生物群的分類組成，很少同時(shí)探討腸道代謝產(chǎn)物的組成。因此，同時(shí)研究自閉癥患者腸道微生物群和代謝產(chǎn)物的組成對我們了解自閉癥的病因至關(guān)重要。在本研究中，從患有自閉癥或有典型發(fā)育（TD）的兒童身上采集糞便樣本，并進(jìn)行宏基因組測序和液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）代謝組學(xué)分析，以確定與自閉癥相關(guān)的腸道代謝產(chǎn)物和微生物組成。

研究結(jié)果：

受試者特征

共有92名患有自閉癥的兒童和42名典型發(fā)育（TD）兒童參加了本研究。人口統(tǒng)計(jì)信息和統(tǒng)計(jì)分析如表1所示。

表1研究對象的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和臨床特征

研究設(shè)計(jì)和分析流程圖如圖S1所示。研究分為兩個階段：在發(fā)現(xiàn)階段進(jìn)行了腸道宏基因組和代謝組學(xué)研究，其中ASD組43例，TD組31例；在驗(yàn)證階段，額外的49名ASD兒童和11名TD兒童被納入代謝組研究。

圖S1 研究設(shè)計(jì)流程圖

ASD的腸道宏基因組組成

比較ASD組和TD組兒童腸道微生物alpha多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與TD兒童相比，自閉癥兒童的腸道微生物物種豐富度顯著降低（圖1a）。為了確定各組的腸道微生物群是否能有效區(qū)分，進(jìn)行了主成分分析（PCA）。PC1和PC2分別解釋了6.5%和5.43%的變化，此外，PC2可以有效地區(qū)分患有ASD和TD的兒童（圖1b）。接下來研究了腸道微生物群在分類和功能水平上的差異，發(fā)現(xiàn)ASD組兒童的Actinobacteria水平明顯高于TD組兒童（圖1c）。Actinobacteria中的Eggerthella lenta豐度與PC2呈顯著負(fù)相關(guān)（圖1d）。

 圖1 ASD患兒腸道微生物組成改變

為了解ASD組和TD組兒童腸道微生物群結(jié)構(gòu)和功能組成的差異，進(jìn)行了MWAS分析，發(fā)現(xiàn)19個顯著不同的分類群：與TD組相比，ASD組兒童的11個分類群明顯更高，包括3個 Clostridium類群,2個 Eggerthella 類群, 2個 Klebsiella類群，ASD組兒童的8個分類群顯著低于TD組。在14個顯著不同的功能途徑中，ASD組的11個明顯高于TD組，包括與苯甲酸鹽降解和酪氨酸代謝相關(guān)途徑。ASD組的3個途徑明顯較低，包括與D-谷氨酰胺和D-谷氨酸鹽代謝和神經(jīng)遞質(zhì)代謝相關(guān)的途徑。

為了進(jìn)一步了解這些腸道微生物群組成差異的生物學(xué)意義，進(jìn)行了相關(guān)和回歸分析。正如預(yù)期的那樣，腸道微生物群分類和途徑的差異是相關(guān)的，值得注意的是，ASD患兒潛在有害的高豐度Clostridium botulinum和Eggerthella lenta以及低豐度Bacteroides vulgatus與D-谷氨酰胺和D-谷氨酸鹽代謝（圖S3a）、芳香族氨基酸代謝途徑：苯甲酸鹽降解（圖S3b）、萘降解（圖S3c）和酪氨酸代謝途徑（圖S3d）相關(guān)：D-谷氨酰胺和D-谷氨酸鹽代謝與Bacteroides vulgatus, Eggerthella lenta DSM 2243呈正相關(guān)，與Clostridium botulinum Ba4 strain 657呈負(fù)相關(guān)；苯甲酸鹽降解（b）、萘降解（c）和酪氨酸代謝途徑（d）與Bacteroides vulgatus呈負(fù)相關(guān)，與Eggerthella lenta DSM 2243, Clostridium botulinum Ba4呈正相關(guān)。

圖S3自閉癥兒童腸道微生物群分類與功能的相關(guān)性

ASD的腸道代謝組分

為進(jìn)一步了解自閉癥患兒腸道微環(huán)境的組成，采用LC-MS/MS進(jìn)行了糞便代謝組分分析，共檢測到297種代謝產(chǎn)物，其中陽性（ESI）和陰性（ESI）分別檢測到123種和174種。PCA分析表明，PC1和PC2能夠分別解釋9.87%和6.78%的變異，ASD和TD組的兒童可以根據(jù)代謝物（圖2a）進(jìn)行區(qū)分。通過對腸道代謝組數(shù)據(jù)集進(jìn)行MWAS分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ASD組和TD組共有31種顯著差異代謝物，其中14種在ASD組兒童中明顯較高，包括兩種膽汁酸衍生物?；悄懰岷?/span>3-硫酸鵝去氧膽酸，剩余17種代謝物在ASD組顯著較低。為了解釋這些差異的生物學(xué)意義，進(jìn)行了代謝路徑豐富度差異分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ASD患兒中明顯較低的代謝物（包括三種代謝物：2-酮-戊二酸、L-天冬氨酸和富馬酸）與丙氨酸（Alanine）、天冬氨酸（Aspartate）和谷氨酸（Alutamate）代謝途徑有關(guān)（圖2b）。因此，腸道微環(huán)境中代謝物的減少主要影響丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代謝，并意味著神經(jīng)遞質(zhì)代謝的改變。

圖2自閉癥患兒腸道代謝組分的變化與腸道微生物群的變化顯著相關(guān)

腸道宏基因組-代謝組學(xué)關(guān)聯(lián)

為了了解腸道代謝物中的重要變化是否與自閉癥兒童腸道微生物群組成有關(guān)，首先對31種不同代謝物和宏基因組成分（PC1/2）進(jìn)行回歸分析，發(fā)現(xiàn)大約一半（16/31）的代謝物與PC1/2顯著相關(guān)，這可能意味著腸道代謝物的變化與腸道微生物群組成的變化有關(guān)。此外，還將不同的代謝產(chǎn)物與不同的宏基因組成分聯(lián)系起來，結(jié)果表明，大多數(shù)代謝產(chǎn)物不僅在分類水平上與腸道微生物群組成相關(guān)（圖S4），而且在功能水平上也與腸道微生物群組成相關(guān)（圖2c）。有趣的是，腸道微生物谷氨酸Glutamate代謝的減少與腸道激素11-deoxy PGF2的改變有關(guān)，而腸道激素皮質(zhì)醇Cortisol的改變與潛在有害細(xì)菌Eggerthella lenta DSM 2243增加有關(guān)。此外，還發(fā)現(xiàn)自閉癥兒童腸胃中的芳香族Aromatic代謝發(fā)生了改變,芳香族Aromatic代謝的改變與腸激素皮質(zhì)醇Cortisol有關(guān)，與Bacteroides vulgatus和Bacilli數(shù)量的變化有關(guān)。

圖S4 ASD和TD兒童的差異腸道代謝產(chǎn)物和差異微生物具有相關(guān)性

圖2c 不同代謝產(chǎn)物與腸道微生物功能途徑有關(guān)

ASD和TD兒童的飲食模式無顯著差異。評估了重要臨床表型（如胃腸道問題GI problems和性別gender）對核心物種分類群和代謝物的影響，發(fā)現(xiàn)胃腸道問題與Bacteroides vulgatus, Eggerthella lenta, Clostridium botulinum, 2-keto-glutaramic acid, cortisol的存在沒有關(guān)聯(lián)。同樣，性別對核心分類群和代謝物的存在也有有限的影響。

最后，為了進(jìn)一步驗(yàn)證不同的腸道代謝產(chǎn)物是否是自閉癥的潛在生物標(biāo)志物，從49名自閉癥兒童和11名TD兒童中收集糞便樣本，并使用LC-MS/MS和系統(tǒng)代謝組學(xué)分析進(jìn)行差異檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與發(fā)現(xiàn)階段一樣，參與谷氨酸代謝的代謝物（如2-keto-glutaramic acid，2-酮基-戊二酸）在自閉癥兒童腸中明顯較低（圖3c和d）。

圖3腸道2-酮基-戊二酸是ASD的潛在標(biāo)志物。（a）較高水平的腸道2-酮-戊二酸與較低含量的腸道微生物群有關(guān)，這些微生物群與D-谷氨酰胺和D-谷氨酸鹽代謝途徑有關(guān)。（b）較低含量的Bacteroides vulgatus與較低水平的D-谷氨酰胺和D-谷氨酸鹽代謝途徑顯著相關(guān)。（c和d）在發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證階段，腸道2-酮-戊二酸的水平分別顯著降低。

綜上所述，患有自閉癥的兒童腸道代謝物成分變化與腸道微生物群組成變化有關(guān)?；陉P(guān)鍵腸道代謝產(chǎn)物和腸道微生物的假設(shè)機(jī)制如圖4所示。簡言之，發(fā)現(xiàn)患有自閉癥的兒童在腸道中芳香化合物、谷氨酸代謝途徑和膽汁酸代謝方面存在異常，這些變化與較高數(shù)量的Eggerthella lenta細(xì)菌和Clostridium botulinum以及較低數(shù)量的Bacteroides vulgatus有關(guān)，這些發(fā)現(xiàn)有助于基于腸道微生物和代謝產(chǎn)物開發(fā)診斷自閉癥的新方法。

圖4  參與ASD發(fā)病機(jī)制的腸道途徑和代謝產(chǎn)物示意圖。自閉癥患兒腸道微環(huán)境以谷氨酸（glutamate）代謝改變?yōu)樘卣?，谷氨酸代謝改變與較低數(shù)量的Bacteroides vulgatus有關(guān)，Bacteroides vulgatus是一種具有谷氨酸代謝的物種，可直接影響神經(jīng)遞質(zhì)抑制/興奮性失衡?；加凶蚤]癥的兒童還表現(xiàn)出腸道代謝物的變化，如較低水平的芳香化合物（aromatic compounds）和較高水平的膽汁酸（bile acids），這與較高含量的Eggerthella lenta和Clostridium botulinum有關(guān)。患有自閉癥的兒童還表現(xiàn)出應(yīng)激激素皮質(zhì)醇（cortisol）水平的改變，這意味著通過下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸對腸道微生物群的影響。

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