多細(xì)胞生物中不同細(xì)胞類型和細(xì)胞特異性功能的產(chǎn)生，很大程度上是基因表達(dá)差異的結(jié)果。單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)方法的發(fā)展，已經(jīng)徹底改變了我們對(duì)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)部和之間基因表達(dá)的理解。隨著單細(xì)胞RNA測(cè)序商用平臺(tái)，特別是10X Genomics的推廣應(yīng)用及生信分析方法的不斷完善，研究者只要利用好手里的特色樣本（例如動(dòng)植物特有物種或者突變體等組織樣本），通過天昊生物提供的10X Genomics細(xì)胞分選系統(tǒng)+高通量測(cè)序一站式服務(wù)，就可以在單細(xì)胞水平高效的分析轉(zhuǎn)錄組情況，快速占領(lǐng)單細(xì)胞研究領(lǐng)域的前沿高地。下面就跟大家分享兩篇在植物和動(dòng)物單細(xì)胞RNA測(cè)序方面的最新研究進(jìn)展。

1、Single-cell RNA sequencing resolves molecular relationships among individual plant cells

題目：單細(xì)胞RNA測(cè)序解析單個(gè)植物細(xì)胞之間的分子關(guān)系

單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)已廣泛用于研究動(dòng)物細(xì)胞特異性基因表達(dá)，但尚未廣泛應(yīng)用于植物。本研究報(bào)道了一種基于商用液滴微流體平臺(tái)（10X Genomics）的高通量scRNA-seq方法，從超過10000個(gè)擬南芥根細(xì)胞原生質(zhì)體中獲得單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組。研究發(fā)現(xiàn)，所有主要組織和發(fā)育階段都存在于這種單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組群體中。此外，還鑒定了不同的亞群和稀有細(xì)胞類型，包括可能的靜態(tài)中心細(xì)胞。根表皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的集中分析定義了從分生組織到根毛和非毛細(xì)胞分化成熟階段的各個(gè)細(xì)胞的發(fā)展軌跡。此外，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組是從根表皮突變體中獲得的，能夠以單細(xì)胞分辨率對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行比較分析，并對(duì)突變基因的影響提供了前所未有的視角。總的來說，這項(xiàng)研究證明了scRNA-seq在植物中的可行性和實(shí)用性，并提供了單細(xì)胞分辨率下擬南芥根的第一代基因表達(dá)圖譜。

實(shí)驗(yàn)材料及結(jié)果

擬南芥根尖單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析

本研究使用10X Genomics Chromium平臺(tái)從野生型擬南芥根尖原生質(zhì)體的三個(gè)生物學(xué)重復(fù)中獲得總共7522個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(圖1A)。每個(gè)細(xì)胞平均獲得了大約75000條reads及5000個(gè)表達(dá)的基因，所有細(xì)胞群體中檢測(cè)到的總基因共計(jì)22000多個(gè)。

通過繪制單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組t分布隨機(jī)鄰域嵌入(tSNE)圖，發(fā)現(xiàn)從每個(gè)生物重復(fù)樣本產(chǎn)生了大量重疊的細(xì)胞分布，表明重復(fù)結(jié)果具有高度的再現(xiàn)性(圖1B)。使用Seurat無監(jiān)督聚類方法得到九個(gè)主要的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組聚類簇(圖1C)。研究人員還根據(jù)在特定根組織/細(xì)胞類型中表達(dá)的86個(gè)標(biāo)記基因的表達(dá)，生成整個(gè)細(xì)胞群體中所有標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄組合圖(圖1D)，以及每個(gè)標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)圖(圖1E和F)?？偟膩碚f，這一分析展示了特定細(xì)胞群被分配到中柱組織(群0和5)、根毛表皮細(xì)胞(4和8)、非毛表皮細(xì)胞(3)、皮層(6)、內(nèi)皮層(7)、分生組織內(nèi)皮層(2)和根冠(1) (圖1G)。這表明scRNA-seq成功地得到了代表所有主要根尖組織類型的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。

圖1、野生型擬南芥根單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的分離和聚類分析

接下來研究者對(duì)組織內(nèi)特定細(xì)胞類型相對(duì)應(yīng)的主要簇內(nèi)的細(xì)胞亞簇進(jìn)行了識(shí)別，主要集中在中柱細(xì)胞分析上。通過使用韌皮部或木質(zhì)部內(nèi)特定細(xì)胞類型的特異性標(biāo)記基因，包括原韌皮部篩細(xì)胞、韌皮部伴細(xì)胞和原木質(zhì)部細(xì)胞，并在代表這些細(xì)胞類型的相應(yīng)韌皮部或木質(zhì)部簇中發(fā)現(xiàn)了相對(duì)較小的亞簇(圖2)。這些結(jié)果表明，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集足以識(shí)別不同的和相對(duì)稀少的細(xì)胞亞型。

圖2、通過tSNE投影圖上的中柱標(biāo)記基因表達(dá)情況來識(shí)別中柱中不同細(xì)胞類型的簇。顏色強(qiáng)度表示每個(gè)細(xì)胞中指定基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。

對(duì)于一些基因來說，轉(zhuǎn)錄水平在單個(gè)簇的細(xì)胞中有所不同，這表明基因表達(dá)存在潛在的發(fā)育梯度。例如，SCR在薄壁組織(分生組織內(nèi)皮層)簇的一端優(yōu)先轉(zhuǎn)錄(圖3A)，而UBP1主要在分化根細(xì)胞的伸長階段表達(dá)，表現(xiàn)出多個(gè)簇細(xì)胞差異轉(zhuǎn)錄本積累(圖3B)。研究者分析了在分生區(qū)或分化區(qū)優(yōu)先表達(dá)的基因，確定了在群體中每個(gè)細(xì)胞中表達(dá)的分生基因與分化基因的比率，獲得所有細(xì)胞分化狀態(tài)圖譜，揭示了最不成熟(即分生組織)的細(xì)胞位于tSNE的中心，逐漸向外部分化的細(xì)胞發(fā)散(圖3C)。

圖3、基因表達(dá)在簇內(nèi)的發(fā)育變化

表皮和靜態(tài)中心細(xì)胞分析

本研究將代表表皮組織和發(fā)育相關(guān)根冠組織的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組(圖1C中的簇1、3、4和8)重新聚類，產(chǎn)生11個(gè)較小的細(xì)胞簇(圖4A)。通過分析這些簇中差異表達(dá)的基因和根表皮和根冠的43個(gè)標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄積累(圖4B)，定義了代表根毛細(xì)胞(簇1、2、3)、非毛細(xì)胞(簇0、8、9)和小柱根冠細(xì)胞(簇10)的簇。為了描述基因在表皮細(xì)胞中的表達(dá)模式，研究者首先分析了前人報(bào)道的根毛基因和52個(gè)先非毛基因的表達(dá)。分別跨越根毛簇和非毛簇中的細(xì)胞(圖4C和D)。這些熱圖顯示了細(xì)胞分化過程中不同基因表達(dá)波動(dòng)。

有趣的是，最不成熟根毛和非毛表皮細(xì)胞的簇(簇2和簇9)由簇7連接，這暗示簇7中的兩種表皮細(xì)胞類型有一個(gè)共同的發(fā)育起點(diǎn)。研究者通過擬時(shí)軌跡分析，推斷了根毛細(xì)胞和非毛細(xì)胞的發(fā)育軌跡 (圖4E和F)及R的Destiny包擴(kuò)展映射圖(圖4G)，并用實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了幾種已知的根毛細(xì)胞分化早期標(biāo)記物(MYC1、EGL3和RHD6)和非毛細(xì)胞分化早期標(biāo)記物(TTG2、GL2和ETC1)的轉(zhuǎn)錄積累，發(fā)現(xiàn)表達(dá)這些早期標(biāo)記物的細(xì)胞起源于簇7 (圖4H)。

圖4、根表皮和根冠組織單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析

為了進(jìn)一步探討表皮細(xì)胞的起源，根據(jù)各個(gè)細(xì)胞內(nèi)早期根毛細(xì)胞調(diào)節(jié)子(MY1、EGL3和RHD6)和非毛細(xì)胞調(diào)節(jié)子(TTG2、GL2和ETC1)基因表達(dá)的重疊程度，發(fā)現(xiàn)簇7中的大部分細(xì)胞表達(dá)至少一個(gè)根毛標(biāo)記基因和一個(gè)非根毛標(biāo)記基因(圖5A)，這意味著這些細(xì)胞某種程度的細(xì)胞命運(yùn)不穩(wěn)定，可能代表表皮細(xì)胞譜系的起源。

靜態(tài)中心(QC)細(xì)胞位于擬南芥根分生組織中的根表皮干細(xì)胞附近。利用52個(gè)已知的QC表達(dá)標(biāo)記基因，研究者發(fā)現(xiàn)簇7下部的相對(duì)小的一組細(xì)胞始終表現(xiàn)出QC標(biāo)記表達(dá)(圖5B)，鑒定了兩個(gè)表現(xiàn)出最大程度QC標(biāo)記基因表達(dá)的細(xì)胞(圖5C)，并鑒定了在2個(gè)假定的QC細(xì)胞中表達(dá)但在其他21個(gè)細(xì)胞中沒有表達(dá)的6個(gè)基因，在分析了它們?cè)谒袉渭?xì)胞轉(zhuǎn)錄組中的轉(zhuǎn)錄累積后，發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)基因(AT2G39220或PLP6 )基本是QC特異性的(圖5D)。這些結(jié)果表明， scRNA-seq數(shù)據(jù)集能夠識(shí)別代表稀少群體的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組。

圖5、靜態(tài)中心( QC )細(xì)胞的鑒定

rhd6和gl2根表皮突變體的單細(xì)胞分析

接下來，本研究探討了scRNA-seq在單細(xì)胞分辨率下分析突變體表型的應(yīng)用。使用rhd6突變體和gl2突變體根原生質(zhì)體進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)，rhd6突變體基本上缺少根毛細(xì)胞，gl2突變體缺少非毛細(xì)胞。將這些單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組與野生型細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)放在一起分析，得到12個(gè)主要簇(圖6A和B)。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)位于根毛細(xì)胞群中的rhd6細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的比例顯著下降，非毛細(xì)胞群中gl2細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的比例也降低 (圖6C)。然后使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組來分析rhd6和gl2突變體中異常表皮細(xì)胞的特征。通過檢查在相對(duì)早期啟動(dòng)表達(dá)的根毛標(biāo)記基因，研究者檢測(cè)到rhd6轉(zhuǎn)錄組中的非毛細(xì)胞群體不正常地表達(dá)這些早期根毛細(xì)胞標(biāo)記。類似地，也檢測(cè)到表達(dá)早期非毛發(fā)標(biāo)記基因的gl2細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的群體。這些發(fā)現(xiàn)表明，一些rhd6和gl2突變表皮細(xì)胞分別保留了表達(dá)毛發(fā)細(xì)胞基因和非毛發(fā)細(xì)胞基因的能力，這意味著這些突變不會(huì)阻斷所有毛發(fā)/非毛發(fā)途徑基因的表達(dá)，因此不會(huì)完全將一種表皮細(xì)胞類型轉(zhuǎn)化為另一種。這也再次證明了scRNA-seq數(shù)據(jù)在確定細(xì)胞亞群和以單細(xì)胞分辨率表征突變表型方面的有效性。

圖6、野生型和根表皮突變體單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組比較結(jié)果

2、Single-cell transcriptome provides novel insights into antler stem cells,a cell type capable of mammalian organ regeneration

題目：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組為鹿茸干細(xì)胞這類可使哺乳動(dòng)物器官再生的細(xì)胞提供新的見解

鹿角再生是一種基于干細(xì)胞的表面再生過程，有潛力成為再生醫(yī)學(xué)的一個(gè)有價(jià)值的模型。用于鹿茸發(fā)育的鹿茸干細(xì)胞庫位于鹿茸骨膜中。然而，這個(gè)ASC庫是同質(zhì)的還是異質(zhì)的還并不十分清楚。在本文中，研究者首次使用10X Genomics平臺(tái)，通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法(scRNA-seq)對(duì)鹿茸干細(xì)胞進(jìn)行了測(cè)定。共有4565個(gè)鹿茸干細(xì)胞被測(cè)序并組成一個(gè)大的細(xì)胞群，這表明在AP的ASC可能是一個(gè)同質(zhì)群體。scRNA-seq數(shù)據(jù)顯示，腫瘤相關(guān)基因在這些同質(zhì)ASCs中高度表達(dá)。對(duì)干細(xì)胞標(biāo)記物的篩選結(jié)果表明，干細(xì)胞可能被認(rèn)為是胚胎干細(xì)胞(CD9)和成體干細(xì)胞(CD29、CD90、NPM1和VIM)之間的一種特殊類型的干細(xì)胞。本研究結(jié)果第一次在單細(xì)胞水平上對(duì)鹿茸干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了綜合分析，并且只鑒定出了鹿茸骨膜中的一種主要細(xì)胞類型和一些關(guān)鍵的干細(xì)胞基因，這可能是為什么鹿角這種獨(dú)特的哺乳動(dòng)物器官一旦丟失就能完全再生的關(guān)鍵。

實(shí)驗(yàn)材料及結(jié)果

本研究通過對(duì)鹿茸骨膜（AP）細(xì)胞的分離，獲得含有約7500個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液，利用10X Genomics平臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞分選流程及后續(xù)高通量測(cè)序，完成單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)。

高質(zhì)量scRNA-seq數(shù)據(jù)的獲得

實(shí)驗(yàn)共獲得252818309個(gè)reads被映射到14993個(gè)基因上，這些基因在4731個(gè)鹿茸干細(xì)胞（ASCs）中表達(dá)。條形碼UMI計(jì)數(shù)曲線的急劇下降，表明細(xì)胞相關(guān)條形碼與空液滴的良好分離(圖1a)。通過基因數(shù)量(圖1b)和線粒體基因的百分比(圖1c)相對(duì)于每個(gè)細(xì)胞相應(yīng)UMI數(shù)結(jié)果，排除異常潛在的多細(xì)胞小液滴，最終共保留了4615個(gè)單細(xì)胞和13173個(gè)基因用于后續(xù)分析。

圖1、使用10X Genomics對(duì)ASC單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的質(zhì)控結(jié)果

ASC大細(xì)胞聚類群

基于不依賴已知標(biāo)記的最近鄰域類算法，從4615個(gè)高質(zhì)量細(xì)胞中得到兩個(gè)細(xì)胞簇(圖2a)。進(jìn)一步根據(jù)基因表達(dá)將這些細(xì)胞分成兩個(gè)不同的細(xì)胞群(圖2b)。研究者在小簇(50個(gè)細(xì)胞)中沒有發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因。然而，大量下調(diào)的線粒體基因被表達(dá)，這強(qiáng)烈表明小簇可能被ASCs碎片污染。發(fā)現(xiàn)大細(xì)胞群( 4565個(gè)細(xì)胞)中的ASCs表達(dá)高水平的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，如膠原蛋白家族，這些基因通常被用于測(cè)量從間充質(zhì)干細(xì)胞到成骨細(xì)胞、骨祖細(xì)胞和軟骨基因增生的分化狀態(tài)。基于0.2的更高分辨率，大細(xì)胞群又可被分成兩個(gè)群，分別有2404個(gè)和2161個(gè)細(xì)胞(圖2c)，但是只有四個(gè)基因的絕對(duì)對(duì)數(shù)具有2倍變化值(圖2d)，表明AP中的ASC群體可能代表相似群體。

圖2、基于無監(jiān)督圖的ASCs t-SNE分析

ASCs中高表達(dá)基因

總共有35個(gè)基因被發(fā)現(xiàn)在大細(xì)胞群的細(xì)胞中高表達(dá)，基于它們的表達(dá)水平對(duì)它們進(jìn)行進(jìn)一步分類(圖3a)。使用免疫熒光染色進(jìn)一步證實(shí)TMSB10、LGALS1 (圖3b)和VIM (圖4a ) 蛋白的高表達(dá)。在所選的35個(gè)基因中，25個(gè)被發(fā)現(xiàn)參與了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(圖3c)，這表明它們可能會(huì)聚集在一起以適應(yīng)ASCs中的特定生物功能。

圖3、scRNA-seq中高表達(dá)基因驗(yàn)證及分析

干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)

為了研究干細(xì)胞標(biāo)志物在大細(xì)胞群中的表達(dá)狀況，研究者基于兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)從scRNA-seq數(shù)據(jù)中選擇了16個(gè)標(biāo)志物基因：(1)在至少一個(gè)UMI計(jì)數(shù)中表達(dá)，(2)在超過3 %的ASCs中表達(dá)。這16種標(biāo)記基因隨后根據(jù)文獻(xiàn)中每種類型的定義，被分成四種類型的干細(xì)胞標(biāo)記：間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記、胚胎干細(xì)胞標(biāo)記、神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物和癌癥干細(xì)胞標(biāo)志物 (圖4a)。當(dāng)表達(dá)水平設(shè)定為nUMI>5時(shí)，發(fā)現(xiàn)超過40 %的ASCs中表達(dá)了四種間充質(zhì)(CD90、CD29、VIM和NPM1)和一種胚胎干細(xì)胞標(biāo)記基因(CD9) (圖4b)。

圖4、使用干細(xì)胞標(biāo)記物的ASC篩選結(jié)果

使用免疫熒光染色進(jìn)一步證實(shí)了這五種干細(xì)胞標(biāo)基因的高表達(dá)水平(圖5a)。為了進(jìn)一步調(diào)查這五個(gè)標(biāo)記基因中每一個(gè)的陽性細(xì)胞比例，進(jìn)行流式細(xì)胞FACS多色分析，結(jié)果顯示CD9+、CD90+、CD29+、VIM+和NPM1+分別在91.1 %、93.2 %、92.8 %、98.4 %和94.5 %的ASCs中呈陽性(圖5b)，這與scRNA-seq數(shù)據(jù)分析的結(jié)果一致。

圖5、血管平滑肌細(xì)胞免疫染色和流式細(xì)胞儀分析

關(guān)于天昊

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