【昊閱讀】人類基因組調(diào)控元件到底調(diào)控了誰？最新的CELL文章給出研究方案

發(fā)稿時(shí)間：2019-01-14來源：天昊生物

2019年1月3日，最新的CELL文章結(jié)合了最前沿的兩個(gè)技術(shù)-- CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)和單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，探究了基因組調(diào)控元件與其真正的靶基因關(guān)系配對(duì)。隨著基因組研究技術(shù)的不斷發(fā)展，相信研究者會(huì)解開更多的基因組未知信息。今天，小編就和大家一起看看這篇文章是怎么樣的一種研究方案。

英文題目：A Genome-wide Framework for Mapping Gene Regulation via Cellular Genetic Screens

中文題目：通過細(xì)胞遺傳篩選定位基因調(diào)控的基因組框架

發(fā)表期刊：Cell

影響因子：31.4

敲重點(diǎn)：
? 擾亂了5,920個(gè)人類候選增強(qiáng)子對(duì)基因表達(dá)的影響

? 每個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組含有約28個(gè)多重 CRISPRi擾動(dòng)

? 提升eQTL分析框架，確定了664個(gè)順式人類增強(qiáng)子-基因?qū)?

? 確定與這些增強(qiáng)子-基因?qū)ο嚓P(guān)的基因組特征

圖： 摘要圖片版

研究背景

?  人類基因組中已鑒定了超過一百萬個(gè)候選調(diào)控元件，但幾乎所有元件都未經(jīng)驗(yàn)證且其靶基因也是不確定的。

?  確定每個(gè)候選原件是否真正起作用，如何起作用，以及確定每個(gè)遺傳關(guān)聯(lián)的真正功能性變異，將需要基于大量基因組序列的功能研究。

研究方法

?  作者提出了一個(gè)多重的表達(dá)數(shù)量性狀基因座（eQTL）-增強(qiáng)子-基因?qū)Φ目蚣?，研究方法是通過在每個(gè)細(xì)胞引入CRISPR / Cas9介導(dǎo)的擾動(dòng)的隨機(jī)組合，然后進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序（RNA-seq）。

圖：多重增強(qiáng)子-基因?qū)Y選方法

l  預(yù)實(shí)驗(yàn)確定研究方案可靠性—針對(duì)K562細(xì)胞中的1,119個(gè)候選增強(qiáng)子進(jìn)行多重增強(qiáng)子 - 基因?qū)Y選測(cè)試

A：基于增強(qiáng)子相關(guān)特征選擇1,119個(gè)候選增強(qiáng)子，每個(gè)設(shè)計(jì)兩個(gè)特異性靶向gRNA

B：

（i）將gRNA克隆到慢病毒載體中，并以高感染復(fù)數(shù)遞送至K562細(xì)胞。 （ⅱ）對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞RNA-seq，同時(shí)捕獲每個(gè)細(xì)胞中存在的多個(gè)gRNA。 

（iii）對(duì)于每個(gè)候選增強(qiáng)子，根據(jù)是否包含靶向它的gRNA進(jìn)行細(xì)胞分組。 （iv）對(duì)于每個(gè)這樣的細(xì)胞分組，我們測(cè)試了兩者之間候選增強(qiáng)子1 Mb范圍內(nèi)基因的群體表達(dá)差異

l  升級(jí)試驗(yàn)--作者使用dCas9-KRAB干擾了5,920個(gè)候選增強(qiáng)子（對(duì)其靶基因沒有強(qiáng)烈的先驗(yàn)假設(shè)），通過分析254,974個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)確定干擾效果。

研究結(jié)果

l  預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：（圖C）將gRNA以高感染復(fù)數(shù)遞送至K562細(xì)胞，每個(gè)細(xì)胞鑒定中值為15±11.3個(gè)gRNA。 （圖D）產(chǎn)生總共47,650個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜。每個(gè)擾動(dòng)的中位數(shù)為516±177個(gè)細(xì)胞。 （圖E）差異表達(dá)測(cè)試的分位數(shù) - 分位數(shù)圖。（圖F）靶向轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)（頂行）和b-珠蛋白LCR陽性對(duì)照（底行）的表達(dá)。被gRNA靶向干擾的基因與NTC（未靶向?qū)φ眨┫啾?，表達(dá)差異顯著。

l  升級(jí)試驗(yàn)結(jié)果：（圖A）對(duì)于升級(jí)試驗(yàn)，設(shè)計(jì)gRNA以靶向總共5,779個(gè)候選增強(qiáng)子。（圖B）從K562 DHS中選取948個(gè)探索性候選增強(qiáng)子。對(duì)預(yù)試驗(yàn)的978個(gè)候選增強(qiáng)子用相同的gRNA對(duì)重新靶向，并且其中377個(gè)也用第二個(gè)替代gRNA進(jìn)行靶向。（圖C）gRNA再次遞送至K562細(xì)胞，但感染復(fù)數(shù)高于預(yù)實(shí)驗(yàn)（每個(gè)細(xì)胞中位數(shù)為28±15.3gRNA）。（圖D）共產(chǎn)生207,324個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜。每個(gè)擾動(dòng)在915±280個(gè)單細(xì)胞中鑒定。

（圖E）差異表達(dá)測(cè)試的Q-Q圖。顯示了靶基因表達(dá)（橙色）的減少。

（圖F）每個(gè)候選增強(qiáng)子影響的靶基因數(shù)目的直方圖（10％經(jīng)驗(yàn)FDR）。

（圖G）作為調(diào)節(jié)每個(gè)靶基因而檢測(cè)到的成對(duì)候選增強(qiáng)子數(shù)的直方圖（10％FDR）。

（圖H）篩選出664個(gè)（470個(gè)高可信度）增強(qiáng)子-基因?qū)Φ男?yīng)值（通過10%FDR）。97%的TSS對(duì)照，測(cè)序數(shù)據(jù)確定其基因表達(dá)被抑制。

l  單例實(shí)驗(yàn)對(duì)22個(gè)選定的Enhancer-Gene對(duì)進(jìn)行復(fù)制和驗(yàn)證（包括16個(gè)增強(qiáng)子-基因?qū)?，?個(gè)沒有靶基因的增強(qiáng)子）。驗(yàn)證結(jié)果表明，13個(gè)增強(qiáng)子的效力和方向與前期試驗(yàn)一致，而3/16未能驗(yàn)證。

l  解析人類增強(qiáng)子的性質(zhì)以及增強(qiáng)子和配對(duì)靶基因啟動(dòng)子之間的距離:（圖A）成對(duì)的候選增強(qiáng)子在位置上靠近靶基因。（圖B）470個(gè)高可信度對(duì)中的317個(gè)靶向最近端的K562表達(dá)基因。（圖C）增強(qiáng)子對(duì)不同基因群的調(diào)控效應(yīng)。（圖E）增強(qiáng)子 - 基因?qū)υ?/span>K562 Hi-C數(shù)據(jù)中表現(xiàn)出更頻繁地相互作用。

研究結(jié)論：該研究框架將促進(jìn)增強(qiáng)子-基因調(diào)控相互作用的大規(guī)模圖譜繪制，增強(qiáng)子 - 基因調(diào)控相互作用是人類基因組順式調(diào)控環(huán)境中一個(gè)關(guān)鍵但尚未完全已知的組成部分。