1+1大于2 ! 微生物16S擴(kuò)增子絕對定量測序檢測新模式創(chuàng)雙贏

發(fā)稿時(shí)間：2018-09-30來源：天昊生物

 

目前的細(xì)菌群落研究方法有：磷脂脂肪酸分析技術(shù)、高通量測序技術(shù)等，而細(xì)菌定量法有：氯仿熏蒸生物量碳氮測定法、染色-熒光顯微鏡計(jì)數(shù)法、平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法等。目前微生態(tài)研究論文中常常同時(shí)使用以上多項(xiàng)技術(shù)，例如最常用的就是qPCR絕對定量檢測細(xì)菌總拷貝數(shù)和常規(guī)微生物16S擴(kuò)增子測序檢測細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的聯(lián)合使用了。實(shí)際上如何將細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和細(xì)菌絕對定量有機(jī)結(jié)合起來從而同時(shí)獲得細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和細(xì)菌菌種絕對拷貝數(shù)是目前微生物研究領(lǐng)域的一個技術(shù)趨勢，同時(shí)對微生態(tài)的分析工作具有重大意義，今天小編就向大家介紹微生態(tài)研究最常用的幾項(xiàng)技術(shù)，其中既有目前市場上最常用的兩項(xiàng)技術(shù)，又有一項(xiàng)我們天昊自主研發(fā)的“1+1大于2” 檢測新技術(shù)，那下面就看看哪個才是適合不同微生態(tài)研究目的那個它。

Number1

qPCR絕對定量檢測

 

涉及技術(shù)：qPCR絕對定量

原理：

• 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，將已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品梯度進(jìn)行稀釋，一般可以10倍稀釋5-7個梯度，進(jìn)行qPCR檢測， Ct值與樣品中起始模板拷貝數(shù)的對數(shù)呈線性反比關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線；
• 對樣品進(jìn)行目的基因（例如細(xì)菌16S rDNA區(qū)/真菌ITS區(qū)）qPCR檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中物種的絕對拷貝數(shù)。

優(yōu)點(diǎn)：

• 個性化強(qiáng)，針對目標(biāo)菌種設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行絕對定量檢測

局限性：

• 對引物特異性要求較高，引物優(yōu)化難度較大（見下圖）

 

Number2

常規(guī)微生物16S擴(kuò)增子測序

 

涉及技術(shù)： 基因組目的區(qū)域PCR+二代測序；

原理：通過對基因組目的區(qū)域（細(xì)菌16S rDNA區(qū)/真菌ITS區(qū)）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將目標(biāo)區(qū)域DNA擴(kuò)增富集后進(jìn)行高通量二代測序，然后將得到的序列與特定數(shù)據(jù)庫比對，確認(rèn)物種，將16S rDNA 序列相似性高于97% 的不同序列定義為一個OTU，即每個OTU對應(yīng)于一個不同的 16S rDNA 序列，然后通過計(jì)算某一OTU分類單元的序列數(shù)占總序列數(shù)的比值來獲得物種相對豐度數(shù)據(jù)。通過OUT聚類分析，就可以知道樣品中的微生物結(jié)構(gòu)組成和不同微生物的相對豐度。

優(yōu)點(diǎn)：

• 高通量測序，大數(shù)據(jù)量、低花費(fèi)
• 客觀還原菌群結(jié)構(gòu)及相對豐度比例

局限性：

• 只能進(jìn)行物種相對定量檢測，不能反映物種絕對豐度情況（見下圖）

 

   

Number3

微生物16S擴(kuò)增子絕對定量測序

 

涉及技術(shù)：（樣本基因組目的區(qū)域PCR+ spike-in standards目的區(qū)域PCR）+二代測序；

原理：該方法通過向樣品DNA中添加一定量spike-in standards人工合成序列，進(jìn)行16S擴(kuò)增子文庫構(gòu)建、測序，再根據(jù)spike-in standards的16S擴(kuò)增子reads數(shù)及其絕對拷貝數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品中OTU代表序列對應(yīng)物種16S rRNA基因絕對拷貝數(shù)。添加16S spike-in standards到樣品模板中進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增子高通量測序較好的解決了樣本中微生物的絕對定量問題，同時(shí)也能得到樣本中的物種組成信息。

優(yōu)點(diǎn)：

•  三合一: 常規(guī)微生物16S擴(kuò)增子測序+總細(xì)菌絕對定量+特定菌種絕對定量
•  解析樣本中總細(xì)菌的絕對拷貝數(shù)
• 解析樣本中絕大多數(shù)優(yōu)勢物種的絕對拷貝數(shù)
• 同時(shí)客觀還原樣本菌群結(jié)構(gòu)

 

局限性：

• 測序數(shù)據(jù)量高于常規(guī)微生物16S擴(kuò)增子測序，成本有所增加
•  目前階段只適合常規(guī)樣本檢測，例如土壤樣本和糞便樣本

 

微生物16S擴(kuò)增子絕對定量測序新檢測模式發(fā)揮“細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)+ 細(xì)菌絕對定量”兩種檢測技術(shù)的各自優(yōu)勢，變‘兩張皮’為‘一盤棋’，最大限度地便利了微生態(tài)研究者的便利。

 

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