天昊客戶新文：茅蒼術(shù)葉片和根部內(nèi)生菌定植線索

發(fā)稿時間：2018-08-21來源：天昊生物

南京師范大學生命科學學院近期在土壤學領(lǐng)域一區(qū)雜志《Plant Soil》上發(fā)表了茅蒼術(shù)葉片和根部內(nèi)生菌分布的文章。在這項研究中天昊生物有幸承擔了樣品的擴增子測序工作。在恭喜客戶又發(fā)表文章同時，我們想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文題目：Colonization cues of leaf- and root-inhabiting bacterial microbiota of Atractylodes lancea derived in vitro and in vivo

期刊名：Plant Soil     

發(fā)表時間： 2018年6月

影響因子：3.052

研究背景: 

微生物群與植物在植物葉片或根系內(nèi)建立了穩(wěn)定的共生微生態(tài)系統(tǒng)。植物已經(jīng)進化出了一套微生物群落定植機制來嚴格地篩選能夠進入植物內(nèi)部的環(huán)境微生物。以往的研究表明，由于土壤微生物對根分泌物的趨化作用，土壤和根際微生物群落存在顯著差異。因為葉片表面入口點的限制以及和葉片營養(yǎng)成分較少導致空氣傳播細菌和葉片內(nèi)生細菌也有區(qū)別。植物葉或根可分別從空氣或土壤微生物群中選擇棲息的微生物群。葡萄微生物區(qū)系研究表明，盡管根棲細菌種群與葉棲細菌有顯著差異，但棲息于葉、花或葡萄上的細菌與土壤細菌共有的比例要高于它們相互之間共有的比例，這表明土壤細菌可以通過根運輸?shù)降厣稀Ｄ壳罢J為土壤微生物的來源是土壤和空氣中的微生物。目前還沒有直接的證據(jù)表明，葉或根棲息的細菌可以在根和葉片之間傳遞，另外在傳遞過程中，葉或根是否選擇細菌也是未知的。此外，以前的研究已經(jīng)表明，葉和根棲息的微生物影響植物性狀，特別是植物次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生與葉或根中的微生物群密切相關(guān)。在傳遞和選擇過程中，葉片和根中的性狀相關(guān)微生物群可能對植物代謝系統(tǒng)產(chǎn)生不同的影響。

茅蒼術(shù)是一種瀕危的中草藥，具有廣泛的藥理活性，不僅與植物生長環(huán)境的非生物因素有關(guān)，而且與植物內(nèi)生菌和植物的共生過程有關(guān)。近年來的研究表明，葉片內(nèi)生細菌可選擇性地從空氣中獲得，根內(nèi)生細菌可選擇性地來自土壤，我們想知道茅蒼術(shù)葉片中是否也含有根部內(nèi)生細菌，同時根部內(nèi)生細菌是否也含有葉片內(nèi)生菌。

研究對象：

將茅蒼術(shù)組培苗1/2 MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)1個月。然后將無菌茅蒼術(shù)組培苗移栽到特殊滅菌實驗裝置，其可以完全分離茅蒼術(shù)地上和地下部分（圖1）。分離裝置的葉室充滿空氣（自然或滅菌空氣），根室充滿土壤（自然或消毒土壤）。一個特殊的帽子（允許空氣通過，但不允許細菌通過孔徑）被擰到所有處理組根室和葉室的端口上。所有實驗裝置都在超凈工作臺上安裝，以確保在擰帽之前葉室中是無菌空氣。每隔5天在在超凈工作臺上向土壤中添加無菌水（5毫升）。四種處理方法為：SnAn：土壤/空氣均自然處理；SnAs：僅空氣無菌處理；SsAn：僅土壤無菌處理；SsAs：土壤/空氣均無菌處理（圖1）。所有處理均有3次生物學重復。九十天后，從四個處理中用無菌剪刀分離植物葉片和根樣品。通過連續(xù)洗滌和超聲處理去盡空氣和土壤來源的顆粒和附生細菌獲得葉和根組織，然后我們用掃描電子顯微鏡（SEM）來確定細菌是否仍然附著在葉片和根面上。

圖1實驗裝置的組裝及溫室實驗裝置的研究

MiSeq測序：細菌測序區(qū)段（V3-V4）； 

研究結(jié)果：

研究植物內(nèi)生細菌起源的受控環(huán)境建立

為了研究細菌在葉和根之間的重新定植，我們設計了一種可以分離植物葉和根隔室的受控環(huán)境裝置（圖1）。每個樣本測93,282±10,823 原始序列，經(jīng)過優(yōu)化過濾后，每個樣本獲得68,187±7860優(yōu)化序列。所有樣品的Coverage均在99%以上。匹配上植物葉綠體或線粒體16S rRNA序列被過濾掉?？諝?/span>/土壤無菌處理（SsAs）組的葉和根內(nèi)生菌在過濾后仍然保留極少數(shù)細菌OTU，這表明我們的實驗裝置可以提供相對無菌的土壤和空氣環(huán)境。但是空氣/土壤無菌處理（SsAs）組的葉片和根內(nèi)生菌的Shannon多樣性指數(shù)與其它組別有顯著性差異（P＜0.05）。

茅蒼術(shù)葉片和根內(nèi)生菌

采用可分離的無菌實驗裝置檢測茅蒼術(shù)葉和根部隔室中的細菌轉(zhuǎn)移。我們的結(jié)果表明在SnAs組（僅空氣無菌處理）的葉片或SsAn（僅土壤無菌處理）的根中檢測到細菌。在我們的研究中，葉片內(nèi)生菌在SnAs組（僅空氣無菌處理）條件下只可能來自根部內(nèi)生菌，根部內(nèi)生菌在SsAn（僅土壤無菌處理）組條件下只可能來自葉片內(nèi)生菌。因此，我們的研究結(jié)果表明，茅蒼術(shù)的葉內(nèi)生菌可以傳遞到根部，根內(nèi)的細菌也可以被傳送到葉片。

此外，還發(fā)現(xiàn)葉片和根際細菌在傳遞過程中具有選擇性，SnAs組（僅空氣無菌處理）或SsAn（僅土壤無菌處理）組的葉片和根內(nèi)生菌之間有顯著差異（圖2A，B）。

同時發(fā)現(xiàn)SnAn（土壤/空氣均自然處理）和SnAs組（僅空氣無菌處理）的根內(nèi)生菌聚類在一起，這表明從土壤中獲得的根內(nèi)生菌是相似的（圖2B）。然而SnAn（土壤/空氣均自然處理）和SsAn（僅土壤無菌處理）的根內(nèi)生菌具有明顯差異（圖2B），這表明SnAn（土壤/空氣均自然處理）和SnAs組（僅空氣無菌處理）的根內(nèi)生菌主要獲得自土壤，SsAn（僅土壤無菌處理）的根內(nèi)生菌主要獲得自葉片，它們顯著不同。

至于葉片內(nèi)生菌，結(jié)果表明，在SnAn（土壤/空氣均自然處理）和SnAs組（僅空氣無菌處理）之間，或在SnAn（土壤/空氣均自然處理）和SsAn（僅土壤無菌處理）之間的葉片內(nèi)生菌沒有發(fā)現(xiàn)明顯的差異。SnAs組（僅空氣無菌處理）或SsAn（僅土壤無菌處理）組的葉片內(nèi)生菌之間有顯著差異，這說明空氣來源和土壤來源的細菌可能同時影響葉片內(nèi)生菌群的分布。但是SsAn（僅土壤無菌處理）組葉片內(nèi)生菌與SnAn（土壤/空氣均自然處理）和SnAs組（僅空氣無菌處理）葉片內(nèi)生菌非相似度遠大于0.37（圖2B），這說明土壤來源的細菌對茅蒼術(shù)葉片內(nèi)生菌結(jié)構(gòu)有相對較大的影響。

圖2不同處理條件下茅蒼術(shù)葉片和根部內(nèi)生菌結(jié)構(gòu)差異

茅蒼術(shù)細菌屬與揮發(fā)油成分的異同

我們發(fā)現(xiàn)了茅蒼術(shù)葉和根中的15個優(yōu)勢菌屬（圖3A）。在SnAs組（僅空氣無菌處理）中發(fā)現(xiàn)了一些葉內(nèi)生菌屬，這些葉內(nèi)生菌屬僅可能來自根。同時，在SsAn（僅土壤無菌處理）中也發(fā)現(xiàn)了一些根內(nèi)生菌屬，其中根內(nèi)生菌屬僅可能來自葉。

此外，在不同處理（圖3A）中，葉片和根之間的內(nèi)生細菌屬也不同：Stenotrophomonas在葉片中的豐度高于根，而在不同處理下，根中的Cupriavidus更為普遍。這說明葉部和根部對于內(nèi)生細菌具有一定的的選擇性，從而造成不同部位內(nèi)生細菌的差異。

同時，熱圖分析還揭示了在SnAn、SnAs和SsAn處理中葉或根中的揮發(fā)油具有細微但顯著的差異：SnAn（土壤/空氣均自然處理）和SsAn（僅土壤無菌處理）的葉片揮發(fā)性油譜不同于SnAs組（僅空氣無菌處理）。同樣，SnAs組（僅空氣無菌處理）和SsAn（僅土壤無菌處理）的根揮發(fā)油譜不同于SnAn（土壤/空氣均自然處理）。

在揮發(fā)油譜相似性的RDA分析中，在RDA1軸（圖3B）中，基于它們是來自葉或根，樣本清楚地聚集在一起，不同的植物部位揮發(fā)油不同。然而，在RDA2軸的中，基于來自SnAn, SnAs, SsAn不同處理，樣本清楚地聚集在一起。只有四個優(yōu)勢細菌屬，Chryseobacterium, Cupriavidus, Flavobacterium, Stenotrophomonas對揮發(fā)油譜也有顯著影響，Cupriavidus和Stenotrophomonas在RDA1軸上的相關(guān)性更大，Chryseobacterium，F(xiàn)lavobacterium在RDA2軸上的相關(guān)性更大，綜上所述，不同來源的細菌屬可能對茅蒼術(shù)不同組織部位的揮發(fā)油代謝過程產(chǎn)生影響。

圖3  不同處理條件下茅蒼術(shù)葉片和根部內(nèi)生菌的差異以及這些菌屬與揮發(fā)油譜的相關(guān)性

研究結(jié)論：

1. 茅蒼術(shù)葉部內(nèi)生菌能夠由空氣中選擇性進入，植物根部也可以從土壤中選擇微生物進入植物體內(nèi)。葉片和根系的內(nèi)生細菌大部分來自土壤，然而，空氣來源的細菌種群也部分參與到根部內(nèi)生細菌種群的構(gòu)建過程。

2. 不同的植物部位（葉部和根部）對于內(nèi)生細菌種群具有一定的選擇性，最終造成葉部和根部內(nèi)生菌群的差異。這些特異性選擇的內(nèi)生菌最終對茅蒼術(shù)的揮發(fā)油代謝過程產(chǎn)生影響。